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Telomeri

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I.STRUTTURA DEI TELOMERI NEI MAMMIFERI

Tuttii cromosomi degli eucarioti si concludono con i telomeri, strutturecostituite da DNA e proteine associate, i quali definiscono leestremità di ogni cromosoma linearizzato.

I.1.Sequenza di DNA

• Leporzioni terminali dei cromosomi lineari sono composte da un repeat(TTAGGG)

• L'esameroè presente in circa 2,000 copie (superiore a 15 kb di DNA)

• 50-150bp di DNA terminale vengono perse ad ogni transizione attraverso ilciclo cellulare

• "L'erosione"naturale dei telomeri contribuisce ad una miriade di processifisiologici (vedi pi avanti)

I.2.t-loops, G-loops, D-loops

• Itelomeri presentano un'estremità 3' ricca in G

• Siforma un t-loop quando l'estremità al 3' a singolo filamentosi ripiega ad ansa appaiandosi alle sequenze esameriche a doppiofilamento; poichè il filamento ricco in G rimuove un'elicaviene a formarsi una D, o loop di sfasamento.

• Laconformazione t-loop conferisce protezione dalle esonucleasi.

I.3.ComponentiProteiche

Leproteine associate ai telomeri includono:

I.3.1.TRF1 (telomeric repeat binding factor 1)

• Espressaubiquitariamente durante tutto il ciclo cellulare

• Silega, con elevata specificità, al TTAGGG repeat come unomodimero (in corrispondenza dei t-loops)

• Funzionain cis per inibire l'allungamento (elongation) dipendente dallatelomerasi

• Partecipaalla regolazione del fuso mitotico

• E'regolata a rotazione dalle proteine: TIN2, TANK1, TANK2 (vedi diseguito)

• Regolatorenegativo dell'allungamento telomerico (pathway dipendente dallatelomerasi)

• Alcunidati suggeriscono un ruolo per TRF1 nella risposta alle rotture delDNA a doppio filamento breaks

I.3.2.TRF2 (telomeric repeat binding factor 2) 2)

• Espressaubiquitariamente durante tutto il ciclo cellulare

• Silega, con elevata specificità, al TTAGGG repeat come unomodimero

• Localizzataai t-loops, è coinvolta nella loro formazione

• Ildominio C-terminale è omologo ai protooncogeni della famigliaMYB

• Potrebbeessere coinvolta nell'inibizione della forca replicativa

• Stabilizzail filamento sporgente ricco in G e inibisce le fusionitelomero-telomero

• Itelomeri TRF2-negativi sono riconosciuti come DNA danneggiato

• Regolatorenegativo della lunghezza del telomero; l'overespressione di TRF2nelle cellule somatiche = accorciamento telomerico

• L'inibizionedi TRF2 causa l'apoptosi e la ricombinazione di telomerinon-omologhi (non-homologous end joining; NHEJ).

• Promuoveil legame di hRAP1, una proteina associata ai telomeri

I.3.3.hRAP1

• Omologoumano della proteina di lievito

• Regolatorenegativo, in cis, della lunghezza dei telomeri

• InterazioneC-terminale mediata con TRF2

• Funzionenella determinazione della lunghezza telomerica relativa

I.3.4.TIN2 (TRF1-interacting nuclear factor 2)

• Regolala lunghezza telomerica attraverso il legame con TRF1 mediatodall'NH2-terminale

• Ilmutante TIN2 mancante della porzione terminale NH2, portaall'estensione dei telomeri

• Promuovel'appaiamento TRF1-dipendente dei repeats telomerici

I.3.5.TANK1/TNKS (tankyrase, TRF1-interacting ankyrin-related polymerase)

• AttivitàPoly(ADP-ribose) polimerasica (PARP)

• LaADP-ribosilazione di TRF1 mediata dalla Tankyrasi, inibisce illegame ai repeats telomerici

• Promuovel'estensione telomerica

  I.3.6.TANK2/TNKS2 (tankyrase 2) :

• Correlataa TANK1

• L'overespressioneinduce la morte necrotica delle cellule

  I.3.7.WRN (prodotto genico della sindrome di Werner) :

• Sottofamiglia delle RecQ elicasi

• Richiestaper la replicazione del DNA

• Coinvoltanel controllo della stabilità genomica

N.B.Quindi l'attività telomerica pu essere compromessa mediantel'alterazione della funzione di proteine associate al telomero.

II.FUNZIONE TELOMERICA

II.1.Conferisce Stabilità e Protegge le Terminazioni Cromosomiche

• Protezionedalle esonucleasi cellulari

• Protezionedalle ricombinazioni non-omologhe

• Permettealle cellule di discriminare tra terminazioni cromosomiche normali edanneggiate

• Preserval'integrità dei cromosomi permettendo la replicazione senzaperdita delle sequenze codificanti

II.2.Conteggio delle divisioni cellulari

• Valutail numero delle divisioni cellulari che sono avvenute

• Determinala vita media cellulare e quando una cellula entra in senescenzareplicativa

   

  II.3.Fornisce il meccanismo per la replicazione delle porzioniterminali del DNA

• Lareplicazione discontinua sul filamento 'lento' (lagging) coinvolge iframmenti di Okazaki e il templato che deve essere replicato

• Latelomerasi (vedi oltre) aggiunge le sequenze ripetute esameriche al3' terminale, permettendo alla DNA polimerasi di completare lasintesi del filamento opposto

III.MANTENIMENTO TELOMERICO

III.1.Telomerasi

III.1.1.Componente ad RNA: hTERC (human telomerase encoded RNA)

• RNA:AAUCCC, codificata da hTERC

• Serveda templato per la sintesi di TTAGGG

• Espressaconstitutivamente

III.1.2.Componente Catalitica: hTERT (human telomere reverse transcriptase)

• Sintetizzail DNA da un templato di RNA

• Nonè espressa nella maggioranza delle cellule somatiche

• Leproteine associate alla telomerasi includono hEST2, hTEP1, SSB,DKC1(dyskerin)

III.1.3.Meccanismo

• Latrascrizione inversa mediante hTERT sintetizza le sequenzetelomeriche perse durante la replicazione del DNA

• L'attivitàdi hTERT è un fattore critico nella stabilizzazione deitelomeri attraverso l'aggiunta di TTAGGG repeats

III.1.4.Espressione

• Piùdel 90% delle neoplasie riattivano l'espressione di hTERT

• hTERTnon è espresso nella maggior parte dei tessuti somatici

• hTERTè espresso nelle cellule germinali, e nelle celluleimmortalizzate

• L'inattivazionedi hTERT determina un accorciamento dei telomeri

III.2.Allungamento dei telomeri alternativo (alternative lengthening oftelomeres; ALT) indipendente dalla telomerasi

III.2.1.La lunghezza dei telomeri sintetizzati mediante ALT è di normaeterogenea

III.2.2.La lunghezza dei telomeri è dinamica, varia regolarmente

III.2.3.Attivo nelle neoplasie indipendenti dalla telomerasi (~10-15% ditutte le neoplasie)

III.2.4.Preferenzialmente attiva nelle cellule di derivazione mesenchimale,confrontate con quelle di origine epiteliale

III.2.5.Repressori di ALT espressi nelle cellule normali e in certe celluletelomerasi-negative (i.e., l'attività di ALT e l'attivitàtelomerasica pu co-esistere nelle stesse cellule)

III.2.6.Le proporzioni di cellule ALT(+) sono associate con i corpi di PML(promyelocytic leukemia nuclear body, or PML NB)

• PMLNB comprendono DNA telomerico, proteine TRF1, TRF2, e PML

• IlDNA telomerico, le proteine TRF1, TRF2 e PML co-localizzano tuttenelle cellule ALT(+)

• Laco-localizzazione non è osservata nelle celluletelomerasi-positive (+)

• Ruolopotenziale per PML NB nel differenziamento cellulare, nella crescitacellulare, nell'apoptosi, e un indefinito ruolo nel mantenimentodell'integrità telomerica

III.2.7.Meccanismo di ALT probabilmente coinvolto nella ricombinazioneomologa tra telomeri; sequenze copiate da un singolo telomero a unaltro attraverso l'appaiamento complementare che funge da innesco perla sintesi del nuovo DNA telomerico.

III.2.8.G-loop vs. t-loop, D-loop (vedi sopra per la descrizione dei ruoli)

III.2.9.Esperimenti ottenuti in lievito :

• Hannodimostrato la necessità di proteine per la riparazione delDNA quali RAD50, RAD51, RecQ elicasi per far si che laricombinazione omologa avvenga in modo corretto

• L'inibizionedei pathways per la riparazione dei mismatch hanno mostrato unincremento nell'attività dei pathway di ALT, presumibilmenteperchè la ricombinazione omologa richiede proteine delpathway per la riparazione dei mismatch

IV.SENESCENZA E IMMORTALIZZAZIONE

IV.1.Limite di Hayflick (1961)

• Dimostrazioneche in vitro è possibile un numero limitato di duplicazionicellulari (tra 30-50)

• Ilnumero di duplicazioni cellulari è contato e registrato dallacellula

• Ilsuperamento del limite di duplicazioni induce l'invecchiamentocellulare, o replicativo

IV.2.Telomeri and Telomerasi

IV.2.1.I telomeri hanno una funzione critica nell'invecchiamento cellulare

IV.2.2.I telomeri rilevano il numero di divisioni cellulari

IV.2.3.La telomerasi pu azzerare l'effetto delle divisioni cellulari:

• Attraversola riparazione dei telomeri accorciati o danneggiati

• L'inibizionedelle telomerasi causa la perdita delle sequenze telomeriche eeventualmente l'invecchiamento cellulare

IV.2.4.Sussistono due impedimenti biologici nel prolungare la vita mediadelle cellule umane:

a.M1:senescenza replicativa, o mortalità nelle fase 1 (Ha lafunzione di inibire l'immortalizzazione cellulare)

b.M2: crisi (le cellule in crisi di solito entrano nel pathwayapoptotico, quelle che possono eludere la fase di crisiimmortalizzano). Queste cellule:

1.Esprimono la telomerase
2. Mostrano una lunghezza telomericarelativamente costante
3. Mostrano aneuploidia
4. Mostranotraslocazioni non-reciproche
5. Insieme, questi datisuggeriscono che nella fase di crisi, i telomeri perdono la capacitàprotettiva

IV.2.5.Espressione della telomerasi nelle cellule primarie (umane)

• Causaimmortalizzazione

• Suggerisceche i telomeri sono attivi in fase M1 e M2 e sono fondamentali perla determinazione della vita media cellulare

IV.2.6.L'entità del danno sostenuto dai telomeri

• E'riconosciuto come danno del DNA

• Dàinizio all'arresto del ciclo cellulare p53- dipendente

• Puòindurre invecchiamento cellulare

IV.2.7.La soglia della lunghezza telomerica in grado di indurre senescenza

• Puessere cambiata dall'overespressione di TRF2

• Lecellule possono rilevare cromosomi con una ridotta concentrazione diproteine associate al telomero (ipotesi suggerita)

• L'invecchiamento è determinato dalla lunghezza del telomero ecausato delle proteine legate al telomero

IV.3.Immortalizzazione

• L'immortalizzazionepuò essere realizzata attraverso l'attivazione dellatelomerasi, così che quelle cellule non sono pi limitate dalcontrollo negativo della crescita

• L'espressionein vitro delle subunità enzimatiche della telomerasi nellecellule diploidi causa immortalizzazione

• Laprolungata o costitutiva espressione della telomerasi pu indurreimmortalizzazione

• Lefasi M1, M2 dell'invecchiamento funzionano entrambe per imporre unlimite alla vita media della cellula

V.INVECCHIAMENTO

V.1.Ruolo della lunghezza dei telomeri

• L'invecchiamentoprematuro visto nei topi mancanti della telomerasi pu essere inibitodalla riattivazione dell'espressione della telomerasi

• Lare-espressione della telomersi riporta i telomeri accorciati ad unasoglia di lunghezza critica

• Lastabilità cromosomica è ristabilita

V.2.Ruolo di ATM

• Nell'ataxia-telangectasiaè mutato il prodotto genico (ATM)

• Componenteintegrale nel pathway che riconosce il danno al doppio filamento diDNA

• Coinvoltonella mantenere la lunghezza del telomero attraverso il legame conTRF1; partecipa alla protezione dei telomeri dal NHEJ

• Laperdita di ATM risulta in difetti di riparazione del DNA (in modoparticolare quei pathways coinvolti nella ricombinazioneomologa),nel controllo del ciclo cellulare e nell'aumentodell'incidenza di cancro

• Itopi knockout per ATM-/Terc mostrano telomeri accorciati, aumentodell'instabilità genomica che si riflette in fusionicromosomiche, difetti nella proliferazione e morte precoce

V.3.Disordini Umani di Invecchiamento Prematuro

Aberrazionigenetiche che aumentano il tasso di erosione del telomeri einibiscono la normale riparazione del DNA a livello del telomero,sinergizza nel causare invecchiamento precoce, un fenomeno visto inmolti disordini che mostrano la predisposizione alle neoplasie.

• Discheratosicongenita: telomerasi difettosa con molti telomeri corti; DKC1(dyskerin) proteina che stabilizza hTERC

• Sindromedi Werner: accelerata erosione telomerica

• A-T(ataxia-telangiectasia): accelerata perdita telomerica (vedi sopra)

• Sindromedi Bloom (BLM): la DNA elicasi BLM sopprime ricombinazioni anormali;lega TRF2 nelle cellule ALT(+); permette l'amplificazione telomericamediata dalla ricombinazione

   

  V.4.Telomere Position Effect (TPE) nell'Uomo

• L'espressionedi geni mappati vicino al telomeo varia in accordo alla lunghezzadel telomero

• Soppressionereversibile dell'espressione genica

• Influenzatoda un pi alto livello di organizzazione della cromatina

• Meccanismomediante il quale pu essere regolata l'espressione genica correlataall'età cellulare

VI.INSTABILITA' GENOMICA E NEOPLASIE

VI.1.Ruolo della lunghezza dei telomeri

• L'instabilitàgenomica è facilitata in presenza di telomeri accorciati

• Idati suggeriscono fortemente che gli step cruciali nello sviluppo eprogressione della neoplasia includono la disregolazione deitelomeri e della telomerasi

• Quandouna lunghezza critica del telomero è stata raggiunta, icromosomi iniziano a fondere le loro estremità, portando lecellule in crisi.

VI.2.Espressione della Telomerasi

VI.1.1.La riattivazione dell'espressione della telomerasi correladirettamente con le neoplasie, supportando la teoria che ilmantenimento della telomerasi e dei telomeri porta alla formazionedei tumori.

VI.1.2.L'espressione di hTERT da sola causa l'immortalizzazione; latrasformazione cellulare richiede l'immortalizzazione accompagnatadall'inattivazione di geni soppressori tumorali e l'attivazione dioncogeni cellulari.

VI.1.3.L'accorciamento del telomero pu servire per inibire molti stadi dellacrescita tumorale; comunque, l'accorciamento telomerico,particolarmente nel contesto di una disregolazione del ciclocellulare, pu facilitare la neoplasia mediante:

• Esercitandouna pressione selettiva che favorisce i cloni immortalizzati

• Promuovendol'accumulo di cambiamenti genetici

VI.1.4.Recenti dati suggeriscono che la riattivazione della telomerasicontribuisce allo sviluppo della neoplasia attraverso pathwaysindipendenti del mantenimento telomerico

• Stabilizzandocambiamenti cromosomici

• Favorendola crescita di cloni immortalizzati

• Conferendoresistenza all'apoptosi (alcuni dati suggeriscono che l'espressionedi hTERT conferisce questo attributo)

VI.3.Instabilità Cromosomica e Genomica

VI.3.1.Studi molecolari e citogenetici hanno identificato che i cromosomicon anche una sola estremità non protetta sono geneticamenteinstabili fino a che l'integrità telomerica non vieneristabilita. Durante questo periodo di instabilità genomica,avvengono delle fusioni tra due estremità cromosomiche(breakage-fusion-bridge BFB), culminanti spesso in aneuploidiecromosomiche.

VI.3.2.BFB cycles e l'instabilità cromosomica promuovono anche lefusioni tra cromatidi fratelli mediante il non-homologous end joining(NHEJ).

VI.3.3.Durante la mitosi, la separazione dei centromeri nei cromosomidicentrici ai poli opposti produce un ponte anafasico, seguito dallarottura del cromosoma, la conseguente fusione delle parti terminalidanneggiate e la promozione di BFB cycles.

VI.3.4.Ricorrenti cicli di amplificazione genica possono originarsi durantel'acquisizione di nuovi telomeri attraverso i riarrangiamenti deicromosomi, suggerendo che le rotture del DNA a doppio strand sonoimportanti nella promozione dell'amplificazione di geni prossimali alpunto di rottura cromosomica.

VI.3.5.Al fine di sopravvivere, le cellule geneticamente instabili devonoanche evadere la rilevazione da parte dei regolatori del ciclocellulare, come p53, che pu indurre l'arresto del ciclo cellulare oapoptosis in risposta al DNA danneggiato

• Itelomeri pi corti possono essere identificati da p53

• P53si lega al G-rich, DNA telomerico a singolo filamento e interagisceanche con il t-loop

• Laperdita della funzione di p53 e l'accorciamento del telomerolavorano insieme per promuovere la tumorigenesi

Collaboratore :Azra H. Ligon

Traduzione :Matteo Brioschi and Alessandro Beghini

MatteoBrioschi, Alessandro Beghini