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Arquitectura de la cromatina en el núcleo en interfase

Introduccción

I. Organización tridimensional de la cromatina en el núcleo en interfase

1. Relación de la cromatina con las estructuras nucleares

2. Noción de territorios cromosómicos

3. Topografía de los territorios cromosómicos

4. Espacios inter-territoriales

5. Modelo de organización de la cromatina en el núcleo en interfase

II. Evolución relativa de los distintos territorios durante la sucesión de los ciclos celulares

III. El núcleo: una estructura dinámica de 4 dimensiones

Conclusión

Introducción

Desde el siglo XIX y el trabajo de Rabl, se han propuesto varias hipótesis sobre la existencia o no de una arquitectura de la cromatina durante la interfase organizada y controladas, tales hipótesis han evolucionado en función de las técnicas de análisis disponibles que permitían su comprobación. Así, para Rabl, debería existir una compartimentalización del núcleo, con cada uno de los cromosomas ocupando un territorio definido. Esta hipótesis se basaba esencialmente en conceptos teóricos, dadas las técnicas disponibles entonces de microscopía óptica. Esta microscopía permitía la observación y descripción de algunas estructuras como el nucléolo, pero no tenía la resolución suficiente para diferenciar las distintas fibras de cromatina entre sí. Estas hipótesis sobre la estructura del núcleo en interfase fueron cuestionadas por los resultados obtenidos por la microscopía electrónica, realizados durante la decenios de 1960 y 1970. Los resultados de estos estudios, a pesar de su excelente resolución, no permitían demostrar la existencia de una arquitectura particular del ADN. La idea más aceptada fue entonces que el núcleo era una simple membrana que contenía en su interior las moléculas de ADN, descondensadas y mezcladas de manera aleatoria. Sin embargo, desde hace unos cuantos años, la aparición y rápido desarrollo de la técnica de Hibridación In Situ con Fluorescencia (FISH, Fluorescent In Situ Hybridization), ha permitido reexaminar el tema desde nuevos puntos de vista. Gracias a estas nuevas técnicas de análisis se han obtenido imágenes que permiten visualizar cada una de las moléculas de ADN dentro del núcleo.

I. Organización tridimensional de la cromatina en el núcleo en interfase

1. 1. Relación de la cromatina con las estructuras nucleares

El componente principal del núcleo, la cromatina, está íntimamente relacionada con las dos estructuras principales del núcleo identificadas en microscopía: la envuelta nuclear y el nucléolo.

a. El nucléolo se identificó durante un tiempo como el lugar de síntesis del . Estas estructuras intranucleares no están rodeadas por membranas y pueden existir en número variable (aunque en general dos por núcleo) en el momento de la transcripción en G1, tras la mitosis. Los nucléolos están compuestos de varios dominios visibles por microscopía electrónica:

• Uno o varios centros fibrilares, correspondientes a los lugares de transcripción de las moléculas de ADN.

• Un componente fibrilar denso que rodea el/los centro(s) fibrilar(es), donde se localizan los transcritos primarios.

• Un componente granular menos denso situado en la periferia, correspondiente a la zona de ensamblaje de los pre-ribosomas.

Así, se puede diferenciar una estructura funcional ligada a la síntesis del ARNr y no pre-establecida, que es indispensable para esta síntesis. Esta síntesis se lleva a cabo a partir de genes repetidos unos pocos cientos de veces en el genoma, y localizados todos en los brazos cortos de cromosomas acrocéntricos (en concreto los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22). Estas regiones se denominan Regiones de Organización Nuclear (NOR, Nuclear Organizing Regions). La aproximación entre sí de estas NOR junto a los componentes necesarios para la transcripción y maduración de ARNr supone la formación del nucléolo (por concentración). Esta proximidad física de los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos podría continuar algunas veces hasta la mitosis, en la que se puede observar la yuxtaposición de varios cromosomas acrocéntricos.

b. El núcleo se encuentra delimitado por una envuelta formada por una doble membrana (membranas nucleares interna y externa, separadas por un espacio perinuclear). En la cara interna de la membrana nuclear interna se puede observar una maraña de filamentos intermediarios, la lamina, formada por tres proteínas: las laminas A, B y C. la lamina tiene muchas interacciones con las proteínas de la membrana nuclear interna y con la cromatina, en relación con sus funciones en la organización de la envuelta nuclear y, probablemente, en la regulación de la expresión génica. De hecho, existe un variado número de reguladores de la transcripción que interaccionan con las laminas, como la proteína HP1, que se une específicamente a la heterocromatina. De esta manera, a través de la lamina, la envuelta nuclear podría participar en la organización de la heterocromatina en el núcleo y en el control regional de por medio de la relocalización de genes mediante el contacto de la heterocromatina para inactivarlos.

2. 2. Noción de territorios cromosómicos

Al comienzo de los 1980´s, las observaciones realizadas tras irradiación de células de Hamster permitieron intuir la existencia de territorios cromosómicos. Sin embargo, fueron las técnicas de hibridación in situ con sondas de pintado cromosómico, las que permitieron visualizar de manera directa el material genético específico de cada uno de los cromosomas, mostrando que cada uno ocupaba un territorio muy bien delimitado, sin mezclarse u ocupando territorios vecinos, y confirmando la teoría de Rabl. Los mismos resultados se han observado para todos los pares cromosómicos constituyendo la primera prueba fehaciente de la existencia de una organización de la cromatina durante la interfase. Dentro de esos territorios bien delimitados, la fibra de cromatina mantiene una organización que permite identificar subdominios correspondientes a los brazos cromosómicos y las bandas cromosómicas. La superficie ocupada por los territorios cromosómicos es más o menos proporcional al tamaño del cromosoma, aunque son otros los parámetros que podrían modular, por ejemplo, el nivel de expresión de cada uno de los cromosomas. Es importante señalar que los territorios cromosómicos no constituyen compartimentos nucleares como el nucléolo, ya que son bastante permeables, como demuestra la existencia de difusión pasiva en el núcleo de moléculas de un tamaño de hasta 500k Da.

3. Topografía de los territorios cromosómicos

¿Existe una organización exacta y muy regulada de los distintos cromosomas entre sí durante la interfase? La respuesta es difícil y todavía no está resuelta, ya que se han publicado resultados distintos e incluso contradictorios a favor o en contra de tal hipótesis. Sin embargo, sí debería señalarse que las primeras investigaciones se llevaron a cabo en distintos tipos celulares, e incluso en diferentes especies, lo que sugiere la existencia de una cierta variabilidad funcional y/o tisular.

Sin embargo, los resultados más recientes parecen confirmar la existencia de una organización no aleatoria de los territorios cromosómicos durante la interfase. Esta organización es, además, función del tamaño cromosómico y/o los genes que contienen. Así, hay una localización preferencial de los cromosomas pequeños hacia el interior del núcleo, mientras que los cromosomas grandes se observan más frecuentemente hacia la periferia. Sin embargo, también es importante el contenido en genes, como lo demuestra el caso de los cromosomas 18 y 19. Aunque ambos son de tamaño comparable, el cromosoma 19, rico en genes, se encuentra más hacia el interior nuclear que el cromosoma 18, pobre en genes, que se observa hacia la periferia. Esta relación, entre una mayor densidad de genes y una posición más central en el núcleo en interfase, ha sido observada también en otros cromosomas.

Por lo tanto, si admitimos la existencia de una organización no aleatoria de los territorios dentro del núcleo, hay otra pregunta a resolver: ¿esta esta organización asociada a una posición concreta de los cromosomas homólogos o de ciertos pares de cromosomas juntos? Una vez más, los resultados obtenidos hasta la fecha son discordantes y no permiten contestar esta pregunta de manera definitiva. Sin embargo, algunas observaciones recientes en cuanto a las posiciones relativas de los cromosomas implicados en translocaciones recíprocas apoyan la idea del posicionamiento regular de los distintos cromosomas entre sí.

4. Espacios inter-territoriales (Figura 1)

Se proponen dos modelos que describen las relaciones existentes entre los territorios cromosómicos vecinos.

a. En el primer modelo, el modelo de dominios intercromatínicos (Interchromatin Domain, ICD), existirían espacios sin cromatina denominados espacios intercromatínicos. Éstos formarían una red de canales tridimensional que comenzarían en los poros de la membrana nuclear y se dispersarían, mediante invaginaciones, entre los territorios cromosómicos. La luz de estos canales tendrían diámetros variados, desde muy pocas micras hasta sólo algún nanómetro. Los espacios intercromatínicos serían los lugares de concentración de todo el material que no es cromatina (cuerpos nucleares, pre-ARNm, factores de transcripción) constituyendo un espacio para el almacenamiento de tales macromoléculas o un espacio en el que tienen lugar determinadas reacciones enzimáticas. De todas maneras, estos espacios también servirían de zonas de circulación a través del núcleo por difusión pasiva simple, permitiendo la distribución de proteínas necesaria para la transcripción salida de sus productos (ARNm).

b. El segundo modelo, el modelo de red intercromosómica (Interchromosomal network, ICN), supone por el contrario la existencia de zonas entre los territorios vecinos en las que las fibras de cromatina correspondientes a cromosomas distintos están íntimamente asociadas. Este modelo se basa en observaciones realizadas en cortes ultrafinos que permiten conservar mejor que las preparaciones estándar de FISH 3D la estructura de la cromatina. De esta manera, cerca del 40% de cada territorio estaría mezclado, en la periferia, con los territorios vecinos. La importancia de la zona frontera estaría en función de la compactación de dentro de cada territorio (cuanto mayor sea la compactación de la cromatina, menor sería la posibilidad de penetración interna), lo que a su vez sería proporcional a la riqueza en genes de cada uno de los cromosomas y a su actividad transcripcional. En este modelo, las proteínas necesarias para la transcripción, replicación, reparación del ADN y los ARNs difundirían libremente entre los bucles de cromatina, sin estar confinadas en determinados espacios. La importancia de este modelo es que concilia la idea de los territorios cromosómicos con la frecuencia observada de translocaciones cromosómicas. Así, para cada cromosoma hay una buena correlación entre la proporción de territorio mezclado, con los territorios vecinos, y la frecuencia de translocaciones recíprocas que implican un par de cromosomas determinados.

Figura 1.

5. Modelo de organización de la cromatina en el núcleo en interfases

Así, diferentes observaciones demostrarían la existencia de un modelo de organización funcional del núcleo en interfase, constituida por territorios cromosómicos que contienen información genética bajo la forma de cromatina. Dentro del núcleo, las proteínas y los productos de ARN pueden difundir libremente hasta su lugar de acción o ser exportado hacia el citoplasma, ya sea mediante la red de canales que separan los territorios y que se encuentran conectados con los poros nucleares (modelo ICD) o directamente a través de los bucles de cromatina de los distintos territorios (modelo ICN). En ambos modelos, la actividad transcripcional, relacionada con el contacto con la cromatina, puede ser regulada mediante la modificación de la accesibilidad a los genes. Los genes activos son accesibles a los complejos transcripcionales debido a que se encuentran más cerca del espacio intercromosómico (en el modelo ICD) o en un gran bucle de ADN (en el modelo ICN). La observación de que la activación de genes puede estar asociada a su relocalización en territorios vecinos permite considerar nuevos modelos de corregulación de la expresión de genes que, aun estando localizados en cromosomas distintos, participan en las mismas vías metabólicas.

Cualquiera que sea el modelo más cercano a la realidad, este tipo de organización de la cromatina permite la inactivación sencilla de grupos de genes mediante la modificación de su posición entre de los territorios, haciéndolos inaccesibles a la maquinaria transcripcional.

Entre los distintos puntos que quedan por aclarar, se encuentra el problema de si la organización de los territorios cromosómicos es un hecho preliminar a la transcripción, que permite su organización y regulación o, por el contrario, es consecuencia de la actividad transcripcional celular, que modifica la compactación de las regiones de cromatina desde regiones inactivas y poco compactadas hasta zonas ricas en genes con proteínas y RNAm resultado de la transcripción.

II. Evolución relativa de los distintos territorios durante la sucesión de los ciclos celulares

¿Están los cromosomas en posiciones aleatorias dentro del núcleo o, por el contrario, se encuentran situados de manera específica entre ellos? Todavía no se conoce la respuesta, pero esta pregunta plantea cuestiones interesantes como si la existencia de tal posicionamiento específico pudiera constituir algún tipo de información epigenética en el contexto de la diferenciación celular y pudiera explicar (o ser explicado por) la expresión diferencial de genes en las distintas líneas celulares. Si esta hipótesis fuera probada, la transmisión de esta información posicional sería de una importancia esencial para mantener las características peculiares de cada tipo celular. Actualmente existen dos argumentos a favor de la existencia de una organización coordinada entre los distintos territorios cromosómicos.

• La probabilidad de ocurrencia de una alteración entre dos cromosomas cuando se exponen a radiación depende de manera notable de la distancia existente entre ellos durante la interfase. Además, se observan frecuencias variables de distintos tipos de asociaciones posibles entre los distintos tipos celulares, lo que sugiere que la posición relativa de los cromosomas varía en función de la línea celular considerada.

• La posición relativa de los distintos territorios cromosómicos entre sí, se transmite en cada división celular a las células hijas. Las observaciones realizadas mediante fluorescencia en células vivas muestran que todos los territorios localizados en la misma mitad del núcleo de la célula madre están asociados a la mitad de cada uno de los núcleos de las células hijas. Actualmente, el mecanismo que se propone para explicar el mantenimiento de la posición relativa tras la metafase, en la que todos los cromosomas se encuentran en el mismo plano, consiste en la separación asíncrona de las cromátidas durante la anafase: los cromosomas que van a localizarse en la mitad más periférica del núcleo (en las células hijas), con respecto al plano de división en la metafase, se separarán antes de los que están destinados a ocupar una posición más central (ver figura 2).

Un elemento importante para la separación asíncrona de los cromosomas podría ser la cantidad de heterocromatina centromérica, indispensable para la cohesión de las cromátidas en el centrómero. De hecho, si se altera esta heterocromatina (por ejemplo, mediante la incorporación de Hoechst que impide la correcta condensación), se observa un reparto aleatorio en las células hijas.

Aunque la posición relativa de los distintos territorios cromosómicos constituya un tipo de información epigenética (lo que debe ser demostrado de manera definitiva), es probable que la transmisión de esta información no sea absoluta y que puedan existir ciertas variaciones más o menos importante que permitan una adaptación funcional de las células.

Figura 2.

III. El núcleo: una estructura dinámica de 4 dimensiones

Los territorios cromosómicos tienen una posición estable en el núcleo durante el ciclo celular, mostrando una inmovilidad global de la cromatina en el núcleo. Los análisis mediante fluorescencia realizados en células vivas muestran una elevada estabilidad de los marcadores trazadores utilizados durante las fases G1, S y G2. Esta inmovilidad está probablemente relacionada con el escaso espacio libre disponible dentro del núcleo, aunque también puede ser debido en parte al anclaje de la cromatina en los diversos compartimentos nucleares, el nucléolo y fundamentalmente la envuelta.

Sin embargo, cuando la escala de análisis se modifica, se puede observar como la cromatina no es una sustancia inerte en el núcleo, pudiéndose observar dos tipos de movimiento.

a. Por una parte, la fluorescencia marca pequeñas regiones cromosómicas (de unas 10 kb) con movimientos a pequeña escala, de distancias inferiores a 0,5 µm. Estos movimientos son de tipo browniano, con giros en todas direcciones y, a pesar de su escasa amplitud, el locus considerado permanece siempre delimitado a una región reducida del núcleo (de alrededor de 1/1000 del volumen total). Por ello, estos movimientos son consistentes con la noción de territorios cromosómicos, claramente individualizados y relativamente inmóviles. No todos los loci analizados muestran las mismas posibilidades de movimiento, algunos parecen menos móviles como el caso de los telómeros, los centrómeros o algunos dominios a lo largo de los cromosomas, correspondientes probablemente a lugares de anclaje de la cromatina con estructuras nucleares.

b. Por otra parte, los movimientos a gran escala estarían en relación a la modificación de la actividad transcripcional de la célula, por ejemplo, cuando una célula vuelve a entrar en la fase quiescente del ciclo celular, o durante la diferenciación celular, como se ha observado en los linfocitos B. Estos movimientos podrían tener un importante papel funcional durante los procesos de diferenciación celular modulando la expresión de algunos genes con un reposicionamiento de estos en regiones que favorezcan, o por el contrario inhiban la transcripción. Más aún, los movimientos de la cromatina permiten explicar la colocalización de los complejos de transcripción en genes situados en cromosomas distintos, existiendo una correlación entre la actividad transcripcional celular y los territorios cromosómicos.

Conclusión

Ya en el siglo XIX, Rabl tuvo la intuición correcta: el núcleo no es un simple organelo que sirve para separar el genoma del citoplasma, sino que juega un papel esencial probablemente en la organización de la cromatina y el control de la expresión génica. Dentro del núcleo, el genoma está organizado en una manera no aleatoria; cada uno de los cromosomas ocupa un territorio bien definido y se mantiene de manera global en tal posición a través de diversos contactos con ciertas estructuras nucleares. Esta organización, que puede ser particular a determinadas células o tejidos, es transmitida a las células hijas durante las sucesivas divisiones celulares. Finalmente, es posible cierto movimiento a nivel de algunos loci, que pueden relocalizarse en otras regiones del núcleo, básicamente durante la diferenciación celular y cambios en la transcripción. Las modificaciones posicionales y la existencia de una organización no aleatoria de los territorios cromosómicos sugiere la existencia en el núcleo de zonas más o menos favorables para la transcripción y expresión génica. Así, de acuerdo a su localización, un gen o grupo de genes podría activarse por completo sin tener que activar cada uno de ellos de manera independiente. Además, la existencia de zonas de exclusión facilitaría la acción de diversas proteínas implicadas en el proceso de transcripción (potenciadoras, polimerasas, etc…) mediante la reducción de dianas potenciales y mediante el incremento de la concentración de factores de transcripción sobre los genes activos. Por lo tanto, existiría una cierta plasticidad génica correlacionada con la movilidad de la cromatina que participaría en la adaptación de la célula a un ambiente cambiante.

La importancia de esta organización y de las estructuras que la mantienen (en particular de la envuelta nuclear) en la regulación funcional del genoma viene demostrada por los problemas asociados a las laminopatías. El análisis de la fisiopatología de estas enfermedades contribuirá probablemente a arrojar más luz sobre los mecanismo de esta meta-regulación de la expresión génica a nivel regional.

Entre los mecanismo de regulación génica, las modificaciones epigenéticas del ADN (metilación de citosinas, metilación y acetilación de histonas) constituyen un eje de investigación muy importante dado el número creciente de evidencias que prueban la relación entre la epigenética (estructura de la cromatina, organización del genoma) y la expresión génica.

Traducción : José Luis Vizmanos (Departamento de Genética, Facultad de Ciencias. Universidad de Navarra. Pamplona, Spain)