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Introduzione

I. Questioni storiche

II. Risposte

II.1. Catene leggere (kappa o lamba)

II.1.1. Catena Kappa: riarrangiamenti dei segmenti V-J

II.1.2. Catena Lambda: riarrangiamenti dei segmenti V-J

II.1.3. Esclusione allelica e isotipo

II.2. Catene pesanti

II.2.1. Riarrangiamenti dei segmenti V-D-J

II.2.2. Switching dell'isotipo

II.3. Igs di membrana e secrete

III. Conclusioni

III.1. Diversità germinale: famiglie multigeniche

III.2. Diversità dovuta a riarrangiamenti del DNA

III.3. Diversità come risultato di ipermutazioni somatiche

Introduzione

Un'immunoglobulina (Ig) è costituita da 2 catene leggere identiche (L) e 2 catene pesanti identiche (H) (per esempio IgG-type); a livello tridimensionale, una catena delle Ig consiste di un dominio variabile N-terminale, V, e uno (per una catena L) o pi (per una catena H) domini costanti C-terminali, C.

Le cellule della linea B sintetizzano le immunoglobuline. Esse sono o esibite sulla membrana (sulla superficie dei linfociti B) o sono secrete (dai plasmociti).

I. Questioni storiche

Nel momento in cui le principali caratteristiche delle immunoglobuline sono state scoperte, si sono presentate un numero di domande:

A

Gli antigeni sono estremamente variabili; per essere in grado di rispondere ad essi, le immunoglobuline devono essere equamente diverse (ci sono da 1011 a 1012 differenti Igs!), ciò corrisponde alla diversità degli aminoacidi delle parti N-terminali delle catene L e H (i.e. ai domini variabili).

Questo riflette l'estrema variabilità dei geni responsabili per la codificazione delle immunoglobuline? (in linea con il modello della teoria germline: 1 gene = 1 catena Ig; in qual caso molti geni potrebbero essere implicati; essi potrebbero essere originati dalla duplicazione di geni ancestrali; ma l'intero genoma umano potrebbe non essere sufficiente per codificare tutte le immunoglobuline!).

Questo riflette un accumulo di mutazioni? (in linea con il modello della teoria delle mutazioni somatiche: in questo caso, solo pochi geni sarebbero implicati, ma numerose mutazioni somatiche prenderebbero poi il posto per produrre la diversità delle immunoglobuline prodotte; comunque questo modello andrebbe contro i principi della genetica principalmente accettati).

Questo riflette uno specifico meccanismo per i geni delle immunoglobuline?

B

Durante il suo differenziamento, una cellula B, prima produce le immunoglobuline di membrana sulla superficie del linfocita B, e poi produce le immunoglobuline secrete dal plasmocita. La sequenza aminoacidica delle catene pesanti delle immunoglobuline di membrana e secrete differisce solo nella parte finale del loro C-terminale: in questo caso sono implicati gli stessi geni?

C

Una cellula B prima esprime le IgM sulla sua superficie e poi, durante il suo differenziamento, potrebbe esprimere le altre classi di Ig (IgG, IgE o IgA) (questo meccanismo è conosciuto come isotype switch): come avviene questo switch? Come possiamo spiegare senza distinzioni la produzione dell'isotipo immunoglobulinico, lo stesso dominio specifico per l'antigene (idiotipo) è espresso?

D

Una cellula B sintetizza un singolo tipo di catena pesante e catena leggera, allo stesso modo il suo genoma ha 2 cromosomi (2 alleli) per ogni locus delle Ig; l'esclusione allelica deve quindi avvenire producendo un fenotipo emizigote: come questa esclusione allelica avviene?

E

Infine, se le regioni variabili vanno incontro a mutazioni, perché non ve ne sono nelle regioni costanti?

Nel topo e nell'uomo vari metodi usati in biologia molecolare e nel clonaggio genico sono stati usati per rispondere a queste domande; noi limiteremo la nostra discussione alle immunoglobuline umane.

II. Risposte

II.1. Catene leggere (kappa o lambda)

II.1.1. Catena kappa: riarrangiamenti dei segmenti genici V-J

Geni IGK (kappa) sul cromosoma 2 in posizione 2p11.

Multipli geni IGVK per le regioni variabili, V (76 geni, dei quali 31 - 35 sono funzionali); 5 geni IGKJ per le regioni di giunzione, J; un singolo gene IGKC per le regioni costanti, C; i geni V, J e C sono separati nel DNA genomico (configurazione germline dei geni delle Ig).

Queste sono famiglie multigeniche (vedere anche la sezione sulle famiglie dei geni, nei geni della Globina "alle duplicazioni del gene ancestrale ne sono succedute delle altre, e le mutazioni di ognuno degli altri geni ha portato alla diminuzione della diversità. Molti di questi geni duplicati sono funzionali...").

In primo luogo il DNA è riarrangiato; questo lo rende possibile alla congiunzione di 1 segmento genico V e 1 segmento genico J; le sequenze intermedie sono poi delete.

L'RNA pre-messaggero è copiato (trascrizione); questo include gli introni

Poi avviene lo splicing; l'eliminazione degli introni dall'RNA premessaggero, che diviene maturo, definito RNA messaggero,

In seguito poi avviene la sintesi proteica (conosciuta come traduzione).

N.B: e' fondamentale non confondere riarrangiamenti del DNA con splicing dell'RNA.

NOTE: solo i geni delle immunoglobuline e i recettori delle cellule T vanno incontro a riarrangiamenti del DNA.

I riarrangiamenti dei segmenti genici V-J avvengono ai segnali di ricombinazione (RS), che includono una sequenza eptamerica (7 nucleotidi) e una sequenza nonamerica (9 nucleotidi), separate da uno spaziatore.

Ogni gene IGKV è seguito a valle (in posizione 3') da un RS costituito da un eptamero CACAGTG, e poi da uno spaziatore di 12 bp,e infine da un nonamero ACAAAAACC.

Ogni gene IGKJ è preceduto a monte (in posizione 5') da un RS costituito, tra il 5' e il 3', da un nonamero GGTTTTTGT, uno spaziatore di 23 bp e un eptamero CACTGTG.

II.1.2. Catena Lambda: riarrangiamenti dei segmenti genici V-J

I geni IGL (lambda) sono in posizione 22q11 sul cromosoma 22; il meccanismo di riarrangiamento dei segmenti genici V-J è lo stesso descritto per i geni IGK: i riarrangiamenti hanno luogo tra uno dei 29 - 33 gene funzionali IGLV e un gene J; sarebbe da notare che ci sono da 4 a 5 geni IGLC funzionali, ognuno dei quali è preceduto da un gene IGLJ.

II.1.3. Esclusione allelica e isotipo

L'esclusione allelica può essere spiegata in parte dalla coordinazione dei riarrangiamenti, e in parte dall'espressione in superficie di una immunoglobulina funzionale, che inibisce i riarrangiamenti e quindi l'espressione di una seconda catena. Solo uno dei cromosomi 14 e uno dei cromosomi 2 (o 22) sono produttivi (risposta alla domanda D).

II.2. Catene pesanti

I geni IGH ("pesanti") sono in posizione 14q32 sul cromosoma 14.

Ci sono 11 geni IGH, 9 dei quali sono funzionali (IGHM, IGHD, IGHG1,IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHA1, IGHA2 e IGHE) e corrispondono rispettivamente a 9 isotipi di catena pesante μ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α2 e ε.

II.1.1. Riarrangiamenti dei segmenti V-D-J

I riarrangiamenti di DNA avvengono tra uno dei 38 - 46 geni funzionali variabili IGHV, uno dei 23 geni di diversità funzionale IGHD, e uno dei 6 geni di giunzione funzionale IGHJ: ci sono anche alcuni RSs, che sono localizzati a valle (in posizione 3') dei segmenti genici V, sia a fianco dei segmenti genici D sia a monte (al 5') dei segmenti genici J. Durante i riarrangiamenti dei segmenti V-D-J, viene formata innanzitutto una giunzione tra 1 D e 1J, e poi una tra 1 V e il complesso D-J.

Note: ci sono anche 2 o 3 open reading frame per i geni D ognuno dei quali può codificare per 2 o 3 differenti sequenze peptidiche. Le giunzioni dei segmenti V-D-J sono caratterizzate anche da delezioni nucleotidiche (mediante un'esonucleasi) e dall'aggiunta random di nucleotidi (....); le regioni V che non risultano, quindi, essere codificate nel genomico dell'individuo aumentano la diversità delle giunzioni V-D-J- dei domini variabili delle catene pesanti delle immunoglobuline.

II.2.2. Switching isotipico

Nei linfociti pre-B, in primo luogo è sintetizzata una catena mu, poiché il gene costante IGHM (CE) è localizzato vicino al riarrangiamento V-D-J. Questa catena mu è associata con la catena pseudo-leggera e la combinazione porta alla formazione del recettore pre-B. La prima Ig completa sintetizzata dai linfociti B è una IgM, nella quale la catena mu è combinata con una catena leggera kappa o lambda .

Durante il suo differenziamento, il linfocita B può esprimere altri isotipi o sub-isotipi delle Ig. Questo implica la sostituzione di un gene IGHC da parte di un altro, come risultato della ricombinazione del DNA (switch isotipico), con l'eliminazione di una intera parte intermedia a loop. L'eliminazione avviene alle sequenze switch (ruolo correlato a quello dell'RSs).

La tipica sequenza è poi come segue: sintesi dell'RNA pre-messaggero, splicing degli introni, risultante nell'RNA maturo, e infine sintesi proteica.

Questo spiega perché 1) un linfocita-B può sintetizzare in primo luogo una IgM e poi, durante il suo differenziamento, una IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), e IgA (IgA1 o IgA2) o una IgE, e 2) esso conserva gli stessi riarrangiamenti dei segmenti V-D-J e riconosce il sito dello stesso antigene (idiotipo) (risposta alla domanda C).

II.3. Igs di membrana e secrete

Lo splicing alternativo dell'RNA pre-messaggero della catena pesante può produrre sia una catena pesante di membrana (Ig di membrana dei linfociti B), o una catena pesante secreta (Ig secrete dal plasmocita), che conservano lo stesso riarrangiamento V-D-J (idiotipo) e la stessa regione costante (isotipo) (risposta alla domanda B).

Note: lo stesso meccanismo (splicing alternativo di un pre- messaggero) esprime le IgMs e le IgDs nelle stesse cellule B (situazione che si verifica nelle cellule B mature che abbandonano il midollo ematopoietico e raggiungono i linfonodi attraverso il circolo)

III. Conclusioni

III.1. Diversità della linea germinale: famiglie multigeniche

La diversità della "linea germinale" dipende dal numero di geni a ogni locus. Ci sono famiglie di geni, che offrono la possibilità di una scelta tra sequenze funzionali simili. Possibili ricombinazioni intergeniche permettono nel tempo l'evoluzione di locus con duplicazione o delezione dei geni.

Questi geni vanno incontro a ricombinazioni e conversioni intrageniche, portando a un mescolamento e a diversità (polimorfismi) tra gli individui.

La presenza di molte open reading frames, nel caso dei geni IGHD, quindi aumenta la possibilità di scelta tra sequenze funzionali simili.

III.2. Diversità dovuta a riarrangiamenti del DNA

La diversità di combinazione - nel senso matematico del termine - permette la potenziale sintesi di un milione di immunoglobuline. I geni IGH permettono la sintesi di circa 6000 catene pesanti, i geni IGK o IGL di circa 160 catene leggere, che è equivalente a circa un milione di possibili combinazioni (6 x 103 x 160).

In aggiunta a questo, durante i riarrangiamenti dei geni IGH delle catene pesanti, vi è l'acquisizione delle regioni N, e l'uso di uno o altri dei frames di lettura per i segmenti genici D alle giunzioni V-D-J, e durante i riarrangiamenti delle catene leggere IGK e IGL, la flessibilità delle giunzioni V-J. Questi meccanismi contribuiscono ad aumentare la diversità di un fattore da 103 a 104 (sintesi potenziale di 109 catene delle Ig).

III.3. Diversità come risultato di ipermutazioni somatiche

Infine, le mutazioni somatiche sono estremamente numerose (ipermutazioni somatiche) e producono molti target caratterizzati dei segmenti genici riarrangiati V-J e V-D-J delle Ig, ma il loro meccanismo di azione non è ancora conosciuto. AID ( activation.induced cytidine deaminase) potrebbe essere implicato sia nell'occorrenza delle mutazioni sia nel meccanismo di switch.

Le mutazioni appaiono durante il differenziamento dei linfociti B nei linfonodi e contribuiscono ad aumentare la diversità delle Igs di un fattore di 103, il che rende possibile raggiungere una potenziale diversità di 1012 differenti Igs. (risposta alla domanda A).

Questi differenti meccanismi di diversità fan si che sia possibile ottenere 1012 differenti immunoglobuline, in grado di rispondere a molti milioni di antigeni conosciuti (risposta alla domanda A).

Il numero di diverse Igs infatti è limitato dal numero di cellule B in una data specie.

Patrizia Colapietro, Alessandro Beghini