Content

I. Introduzione
II. Il nucleosoma
III. Proteine istoniche
    III.1. Core Histones
    III.2. Linker Histones
IV. Step generali nell'assembramento della cromatina
V. Step generali nell'assembramento della cromatina
VI. Fattori di stimolo dell'assembramento
    VI.1. Fattori di interazione degli istoni
    VI.2. Macchine di rimodellamento e enzimi di modificazione degli istoni
VII. Organizzazione del genoma nel nucleo

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I. Introduzione

Nelle cellule eucariote il materiale genetico è organizzato in una struttura complessa composta da DNA e proteine e localizzata in un compartimento specializzato, il nucleo. Questa struttura è stata chiamata cromatina (dal Greco "khroma" che significa colorato e "soma" che significa corpo). Il DNA, che presenta una lunghezza pari circa a due metri, deve essere assemblato, all'interno di ogni cellula, in un piccolo nucleo di alcuni mm di diametro. A dispetto di questo enorme margine di compattezza, il DNA deve essere rapidamente accessibile al fine di permettere la sua interazione con i macchinari proteici che regolano le funzioni della cromatina:

• replicazione
• riparo
  
• ricombinazione.

L'organizzazione dinamica della struttura cromatinica influenza, potenzialmente, tutte le funzioni del genoma.

L'unità fondamentale della cromatina, definita nucleosoma, è composta da DNA e proteine istoniche. Questa struttura prevede il primo livello di compattazione del DNA nel nucleo. I nucleosomi sono distribuiti in modo regolare lungo il genoma a formare un nucleofilamento che può assumere diversi livelli di compattezza (Fig. 1 e 3), risultando in ultimo nel più alto grado di  condensamento che è la metafase cromosomica. All'interno del nucleo interfasico la cromatina è organizzata in territori funzionali.

La cromatina è stata suddivisa in:

• eucromatina
  
• eterocromatina

L'eterocromatina è stata definita come una struttura che non altera la sua condensazione durante tutto il ciclo cellulare mentre l'eucromatina non è condensata durante l'interfase. L'eterocromatina è localizzata principalmente alla periferia del nucleo e l'eucromatina all'interno del nucleoplasma. Possiamo distinguere:

• Eterocromatina costitutiva, che comprende pochi geni ed è formata principalmente da sequenze ripetute localizzate in grandi regioni che coincidono con i centromeri e i telomeri;
  
• Eterocromatina facoltativa composta da regioni attive trascrizionalmente che possono adottare le caratteristiche strutturali e funzionali dell'eterocromatina, così come nel cromosoma X inattivato dei mammiferi.

In questa review definiremo i componenti della cromatina e riassumeremo i diversi livelli della sua organizzazione dal nucleosoma ai domini nel nucleo.

Discuteremo come la variazione nella costituzione in basi della cromatina può influire sulla sua attività e come fattori stimolanti giocano un ruolo critico nell'impartire diversità a questa struttura dinamica.

Infine riassumeremo come la cromatina influenza l'organizzazione del genoma a livello del nucleo.

II. Il nucleosoma

La digestione parziale del DNA assemblato nella cromatina, genera frammenti di 180-200 paia di basi in lunghezza che si evidenziano mediante la migrazione elettroforetica. Questa regolarità della struttura cromatinica successivamente è stata confermata dall'analisi con il microscopio elettronico che ha rivelato la cromatina come particelle regolarmente distanziate come un "filo di perle". La stechiometria del DNA e degli istoni nel nucleosoma risulta 1/1 base sulla loro massa.

Il nucleosoma è l'unità fondamentale della cromatina ed è composto da:

• un nucleo (core)
  
• una regione di legame, definita linker region (una regione internucleosomale) che è adiacente ai nuclei. (Fig.1).

Il core è estremamente conservato tra le specie ed è composto da 146 paia di basi di DNA che compiono 1,7 giri intorno a un ottamero il quale è costituito da due molecole di ciascuno degli istoni H3, H4, H2A e H2B.

La lunghezza della regione di legame, comunque, varia tra specie e tipo cellulare. E'all'interno di questa regione che gli istoni di legame variabili sono incorporati. Quindi, la lunghezza totale del DNA nel nucleosoma può variare con le specie da 160 a 241 paia di basi.

L'analisi ha rivelato, in primo luogo, la distorsione del DNA avvolto intorno all'ottamero e, secondariamente, che le interazioni istone/DNA e istone/istone attraverso il loro "histone fold domain" formano una reminescente configurazione di una mano shake.

III. Proteine istoniche

    III.1. Gli istoni del core (Core Histones)

Gli istoni del core, H3, H4, H2A e H2B, sono piccole proteine basiche estremamente conservate nell'evoluzione (Fig. 2). La regione più conservata di questi istoni è il loro dominio centrale strutturalmente composto dal "fold domain dell'istone" costitutito da tre a-eliche separate da due regioni di legame. In contrasto, le code N-terminali di ogni core istonico sono molto variabili e non strutturate. Le code sono particolarmente ricche in residui di lisina e arginina che le rendono estremamente basiche. Questa regione è il sito di numerose modificazioni post-traduzionali che sono preposte alla modificazione della sua funzione e inoltre alterano l'accessibilità del DNA e le interazioni proteina/proteina con il nucleosoma.

E' significativo notare che altre proteine che interagiscono con il DNA contengono anche il "fold domain istonico".

    III.2. Istoni di legame (Linker Histones)

Gli istoni di legame si associano con la regione di legame del DNA tra due core del nucleosoma e, a differenza degli istoni del core, essi non sono ben conservati tra le specie. Negli eucarioti più evoluti, essi sono composti da tre domini: un dominio centrale globulare non-polare essenziale per le interazioni con il DNA, e due braccia flessibili N- e C- terminali non strutturate che sono estremamente basiche e sono preposte per essere il sito di modificazioni post traduzionali. Gli istoni di legame hanno un ruolo nella spaziatura dei nucleosomi e possono modulare i più alti ordini di compattazione mediante la formazione di un regione di interazione tra nucleosomi adiacenti.

IV. Fasi generali nell'assemblaggio della cromatina

L'assemblaggio del DNA nella cromatina coinvolge una serie di eventi, dalla formazione dell'unità di base, il nucleosoma, fino all' organizzazione complessa di domini specifici all'interno del nucleo. I passaggi dell'assemblaggio del DNA nella cromatina sono descritti schematicamente nella Fig. 3.

1. Il primo passaggio prevede la deposizione nel DNA di un tetramero di nuova sintesi (H3-H4)2 per formare una particella sub-nucleosomale e la successiva aggiunta di due dimeri H2A-H2B. Questo determina la formazione di un core del nucleosoma costituito da 146 paia di basi di DNA avvolto attorno a un ottamero istonico. Il core così formato e il DNA di legame insieme formano il nucleosoma. Gli istoni appena sintetizzati sono specificatamente modificati (e.g. acetilazione dell'istone H4).
   
2. Il passaggio successivo è quello della maturazione che richiede ATP per stabilire la spaziatura regolare dei core dei nucleosomi per formare il nucleofilamento. Durante questo step gli istoni appena incorporati sono de-acetilati.
   
3. In seguito, l'incorporazione di istoni di legame è accompagnata dal ripiegamento del nucleofilamento in una fibra di 30 nm di diametro; la struttura del nucleofilamento rimane da chiarire. Esistono due modelli principali: il modello a solenoide e quello a zig zag.
   
4. In fine, successivi eventi di ripiegamento portano ad un più alto livello di organizzazione e a specifici domini nel nucleo.

A ognuno degli step sopra descritti, si possono ottenere variazioni nella composizione e nell'attività della cromatina mediante modificazioni delle costituenti basiche e l'attività dei fattori di stimolo implicati nei processi del suo assembramento e disassembramento.

V. Variazioni nei costituenti basici

Nel primo step dell'assembramento della cromatina, le particelle elementari possono assumere variazioni:

• A livello del DNA (per esempio mediante la metilazione)
  
• A livello dell'istone mediante la differenziale modificazione post-traduzionale e l'incorporazione di forme varianti (per esempio CENP-A, una variante di H3).

Tutte queste variazioni sono in grado di introdurre differenze nella struttura e nell'attività della cromatina. La vasta gamma di modificazioni post traduzionali delle code degli istoni è riassunta in Fig. 2 (acetilazione, fosforilazione, metilazione, attacco di ubiquitina, polyADP-ribosilazione), e la loro associazione con specifici processi biologici ha portato alla formulazione dell'ipotesi di un linguaggio, riferito come "codice dell'istone", che marca le regioni genomiche (deve essere enfatizzato che questo codice è un ipotesi di lavoro). Il codice è "letto" da altre proteine o complessi di proteici che sono in grado di capire e interpretare i profili delle specifiche modificazioni. L'incorporazione di varianti istoniche potrebbe essere importante per i domini specifici del genoma: in questo contesto, CENP-A, una variante dell'isone H3 è associato con le regione centromeriche silenti e il macro H2A sul cromosoma inattivo X delle femmine di mammifero. H2A-X è implicato nella formazione di foci contenenti fattori di riparo del DNA nelle regioni di rottura del DNA a doppio filamento. Esistono crescenti evidenze che H2A.Z ha un ruolo nella modificazione della struttura cromatinica per la regolazione della trascrizione.

Durante lo step di maturazione che prevede l'incorporazione degli istoni di legame, le proteine associate alla cromatina non istonica, chiamate HMG (High Mobility Group), e altri specifici fattori di legame del DNA aiutano nella spaziatura e nel ripiegamento del nucleofilamento. Quindi i primi step nell'assembramento possono avere un grande impatto sulle caratteristiche finali della cromatina in specifici domini nucleari.

VI. Fattori che stimolano l'assemblaggio

    VI.1. Fattori di interazione istonica

Alcuni cofattori cromatinici (CAF) possono formare complessi con gli istoni e aumentare il processo di deposizione istonica. Essi agiscono come accompagnatori istonici facilitando la formazione dei core dei nucleosomi senza essere parte del prodotto di reazione finale. Questi fattori di interazione istonici, chiamati anche fattori di assembramento della cromatina, possono legarsi preferenzialmente a un sottotipo di proteine istoniche.

Per esempio, Chromatin Assembly Factor-1 (CAF-1) interagisce con gli istoni appena sintetizzati e acetilati H3 e H4 per assemblare la cromatina durante la replicazione del DNA. CAF-1 è anche in grado di promuovere l'assembramento della cromatina specificatamente associata al riparo del DNA. La recente dimostrazione dell'interazione di CAF-1 con la proteina PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) stabilisce un legame molecolare tra l'assembramento della cromatina e i processi di replicazione e riparo del DNA. L'assembramento di strutture specializzate nelle regioni centromeriche, attraverso la deposizione di varianti istoniche come CENP-A o telomeri potrebbe essere un risultato della specificità e diversità di come sono ancora non caratterizzati gli accompagnatori istonici.

    VI.2. Meccanismi di rimodellamento e enzimi modificanti gli istoni

I fattori di stimolo agiscono anche durante la fase di maturazione della cromatina per organizzare e mantenere uno stato cromatinico definito. I loro effetti sulla cromatina possono indurre cambiamenti nella conformazione a livello del nucleosoma o più in generale a livello di grandi domini cromatinici. Questi fattori sono di due tipi: uno che richiede energia sotto forma di ATP, generalmente riferito ai macchinari di rimodellamento della cromatina, e l'altro che agisce come gli enzimi per la modificazione istonica post tradizionale.

• Macchinari di rimodellamento della cromatina: sono complessi multiproteici (SWI/SNF, ISWI, Mi2/NuRD families). L'attività delle ATPasi permette al complesso di modificare la struttura nucleosomale, guidata dalla liberazione di energia durante l'idrolisi dell'ATP. Lo studio dei fattori che stimolano la regolare disposizione dei nucleosomi durante l'assembramento della cromatina ha portato all'identificazione di molti complessi multi proteici, in grado in vitro di "far scivolare" i nucleosomi lungo il DNA. La caratteristica comune di questi fattori per il rimodellamento della cromatina è la loro grande dimensione e la presenza di subunità multi proteiche, inclusa l'ATPase, mentre si differenziano per il numero dei componenti e le attività.
• Modificazioni post traduzionali: l'ipotesi dell' "histone code" è stata proposta per spiegare la diversità dell'attività della cromatina nel nucleo. Le code istoniche non strutturate all'N-terminale si estendono al di fuori del core del nucleosoma e sono i siti di azione per gli enzimi che catalizzano con alta specificità la loro modificazione post traduzionale. La modificazione post traduzionale meglio caratterizzata è l'acetilazione dei residui di lisina. L'acetilazione è il risultato di un equilibrio tra due attività opposte: histone acetyl transferase (HAT) e la histone deacetylation (HDAC) (e.g. HAT A, con un'attività acetiltransferasica dell'istone e HDAC1, una deacetilasi istonica). Numerose proteine che giocano un ruolo nella regolazione della trascrizione hanno un'intrinseca attività acetiltrasferasica istonica. In modo simile, le deacetilasi istoniche sono state descritte come componenti di complessi multi proteici associati alla cromatina non espressa. All'interno di questi complessi vi è anche la famiglia di fattori di rimodellamento Mi-2 che provvede ad un legame tra il rimodellamento dei nucleosomi e la deacetilazione istonica durante la repressione mediata della cromatina.

La metilazione degli istoni funzionalmente gioca un ruolo importante. Una metiltransferasi istonica metila in modo specifico l'istone H3 sul residuo di lisina 9 e questa metilazione modifica l'interazione di H3 con le proteine associate all'eterocromatina.

Le due possibili modificazioni (acetilazione e metilazione) sullo stesso residuo (lisina 9) della coda N-terminale di H3 rappresentano l'ipotesi in azione della "histone code". Infatti, la lisina acetilata nella coda N-terminale di H3 e H4 interagisce selettivamente con il dominio cromatinico presente in numerose proteine aventi un'intrinseca attività acetiltransferasica istonica. L'H3 metilato sul residuo di lisina 9 interagisce in modo specifico con il dominio cromatinico di un'eterocromatina associata alla proteina HP1.

In aggiunta alle alterazioni prodotte nei molteplici cambiamenti delle code istoniche, preposte alla destabilizzazione fisica del nucleosoma, le modificazioni appaiono conferire specificità alle interazioni proteina : proteina con gli istoni. Esse sono associate con differenti regioni del genoma e sono correlate con precise funzioni nucleari.

VII. Organizzazione del genoma nel nucleo

Il più elevato livello di compattamento della cromatina non è ben caratterizzato. Il nucleofilamento è compattato a formare una fibra di 30nm di diametro che è organizzata in ripiegamenti di 150-200 Kbp (250 nm durante l'interfase) fino ad ottenere un massimo livello di compattazione nel cromosoma metafisico (850 nm).

Nell'interfase l'organizzazione del genoma è disposta sulla struttura dei cromosomi che sono stati caratterizzati in differenti regioni in base a uno specifico pattern di bande.

Le bande principali sono:

• Le bande G e C che sono replicate tardivamente nella fase S e corrispondono all'eterocromatina
  
• bande R che replicano più velocemente in fase S e rappresentano l'eucromatina. Le bande R sono ricche in istoni acetilati e questa modificazione è conservata attraverso la mitosi suggerendo l'ipotesi secondo la quale l'acetilazione istonica potrebbe servire come marker per la memoria dell'organizzazione del dominio attraverso il ciclo cellulare.

La localizzazione dei cromosomi nel nucleo interfasico rivela che ogni cromosoma occupa uno spazio definito. Nei mammiferi, l'organizzazione dei cromosomi nel nucleo varia come la funzione del tipo cellulare. Durante l'interfase, le regioni che corrispondo alle bande dei cromosomi metafisici sono localizzate nel nucleo in base alla sincronizzazione della loro replicazione:

• alla periferia del nucleo vi sono le regioni replicate tardivamente, corrispondenti alle bande G e C e i telomeri silenziati trascrizionalmente,
  
• le regioni ricche di geni sono preferenzialmente localizzate più internamente.

Quindi, sebbene ogni cromosoma occupi un territorio differente, parti distinte dei cromosomi possono unirsi a formare domini funzionali. La localizzazione, mediante la FISH, di regioni coincidenti e non-coincidenti suggerisce che i geni tendono a essere localizzati alla superficie dei territori cromosomali. Nel modello basato sulla localizzazione di alcuni geni, i trascritti sono ripiegati nei canali intercromosomali, trasferiti ai siti di processamento, poi esportati al citoplasma dopo la maturazione.

Molti studi hanno portato a ipotizzare che il nucleo sia organizzato in domini. La localizzazione del DNA in questi domini e forse, in parte, una conseguenza delle attività della cromatina. Le proteine target potrebbero aiutare a condurre le proteine specializzate a specifici domini nel nucleo. In un modello ipotetico, le proteine associate con l'eterocromatina (per esempio HP1, Polycomb, Sir3p/Sir4p e ATRX), i fattori di trascrizione (come Ikaros) e i fattori di assembramento (come CAF-1) potrebbero essere tutti coinvolti nello stabilimento e nel mantenimento dei domini nucleari.

Tabella. Nomenclatura riveduta delle proteine cromosomiche HMG.

Lista delle definizioni:

• Cromatina: è il portatore dell'informazione genetica. E' un struttura complessa composta da DNA e proteine ed è localizzata nel nucleo cellulare.
• Macchinari di rimodellamento della cromatina: richiedono energia sotto forma di ATP e inducono cambiamenti nella conformazione a livello del nucleosoma o più in generale a livello di grandi domini cromatinici.
• Eterocromatina costitutiva: è formata principalmente da sequenze ripetute e contiene pochi geni. Generalmente è localizzata in grandi regioni che coincidono con i centromeri o i telomeri.
• Eucromatina: rappresenta la cromatina decondensata durante l'interfase.
• Eterocromatina facoltativa: è composta da regioni trascrizionalmente attive che possono adottare le caratteristiche funzionali e strutturali dell'eterocromatina.
• Bande G, C e R: corrispondono all'organizzazione in bande dei cromosomi metafisici.
• Eterocromatina: rappresenta una forma condensata della cromatina che non si altera nella sua condensazione attraverso il ciclo cellulare.
• Accompagnatori istonici: sono fattori acidici che possono formare complessi con gli istoni e agevolare il processo di deposizione istonica. Essi agiscono come accompagnatori degli istoni facilitando la formazione dei core dei nucleosomi senza essere parte del prodotto di reazione finale.
• Histone code: è l'ipotesi di un linguaggio legato alla vasta gamma di modificazioni post-traduzionali alle code dell'istone e la loro associazione in specifiche attività biologiche. Il significato funzionale dell'interrelazione tra queste modificazioni istoniche è il soggetto di intense investigazioni. Questo codice è "letto" da altre proteine o complessi proteici che sono in grado di capire e interpretare i profili delle specifiche modificazioni.
• Proteine HMG (High Mobility Group): sono proteine associate alla cromatina non istonica. Queste proteine di legame del DNA possono aiutare a distanziare e ripiegare il nucleofilamento.
• Nucleosoma: è l'unità fondamentale della cromatina. E' composto da DNA e proteine istoniche. Esso provvede al primo livello di compattazione del DNA del nucleo.
  
  Patrizia Colapietro, Alessandro Beghini