Abstract

端 粒

I. 哺乳动物端粒结构

I.1.DNA序列

I.2.t环、G环、D环

I.3.蛋白质成分

II.端粒功能

II.1.染色体稳定性

II.2.细胞分裂计数器

II.3.DNA末端的复制机制

II.4.染色体完整性

III.端粒维护

III.1.端粒酶

III.2.端粒独立/端粒延伸替代机制（ALT）

IV.衰老和永生

IV.1.Hayflick界限

IV.2.端粒和端粒酶

IV.3.永生化

V.老化

V.1.端粒长度的作用

V.2.ATM的作用

V.3.人类的疾病早衰

V.4.端粒位置效应（TPE）

VI.基因组不稳定性和肿瘤

VI.1.端粒长度的作用

VI.2.端粒酶的表达

VI.3.染色体和基因组不稳定性

Content

I. 哺乳动物的端粒结构

      所有真核生物的染色体都有端粒覆盖，端粒是由DNA和相关蛋白组成的结构，组成每条线状染色体末端。

I.1. DNA序列

• 由（TTAGGG）重复序列组成的线性染色体末端
• 六聚体单元存在多达2,000个拷贝（最多15 kb DNA）
• 在整个细胞周期中每次传代都会丢失50-150 bp的末端DNA
• 端粒的自然“侵蚀”有助于无数的生理过程（见下文）

I.2. t环、G环、D环

• 端粒具有3'G丰富的突出端
• 当单链3'链环回并退火至双链六聚体重复序列时，会形成t环。当富含G的链置换一条链时，会产生D或置换环
• 环的形成可防止核酸外切

I.3. 蛋白质成分

       端粒结合蛋白包括：

I.3.1 TRF1（端粒重复序列结合因子1）

• 在整个细胞周期中普遍表达
• 以同二聚体（在t环处）结合到TTAGGG重复序列，具有很强的特异性
• 具有抑制端粒酶依赖延长的功能
• 参与有丝分裂纺锤体的调节
• 由TIN2，TANK1，TANK2蛋白依次调控（见下文）
• 端粒长度的负调因子（端粒酶依赖性途径）
• 一些数据表明TRF1在DNA双链断裂反应中发挥作用

I.3.2 TRF2（端粒重复序列结合因子2）

• 在整个细胞周期中普遍表达
• 以同二聚体的形式结合到TTAGGG重复序列，具有很强的特异性
• 定位于t环，参与其形成
• 与原癌基因MYB家族同源的C末端结构域
• 可能参与复制叉的抑制
• 稳定富含G的链突出端并抑制端粒-端粒融合
• TRF2阴性端粒被认为是受损的DNA
• 端粒长度的负调节因子；体细胞中TRF2过表达=端粒缩短
• TRF2抑制导致端粒的凋亡和非同源末端连接（NHEJ）
• 促进端粒相关蛋白hRAP1的结合

I.3.3 hRAP1

• 人酵母蛋白的同源物
• 端粒长度的顺式负调因子
• C末端介导的与TRF2的相互作用
• 决定相对端粒长度的功能

I.3.4 TIN2（TRF1相互作用核因子2）

• 通过NH2-末端介导与TRF1的结合调节端粒长度
• 缺少NH2末端的突变体TIN2导致端粒延长
• 促进依赖TRF1的端粒重复序列配对

I.3.5 TANK1 / TNKS（端锚聚合酶，TRF1相互作用的锚蛋白相关聚合酶）

• 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）活性
• 端锚聚合酶介导的TRF1的ADP-核糖基化抑制与端粒重复序列的结合
• 促进端粒延长

I.3.6 TANK2 / TNKS2（端锚聚合酶 2）：

• 关于TANK1
• 过表达诱导坏死细胞死亡

I.3.7 WRN（Werner综合征基因产物）：

• RecQ亚家族的解旋酶
• DNA复制所需
• 参与控制基因组稳定性

注意：因此，端粒功能可通过影响端粒结合蛋白功能而受损。

II.端粒功能

II.1 稳定和保护染色体末端

• 防止细胞外切核酸酶
• 防止非同源末端连接
• 允许细胞区分天然染色体末端和受损的DNA
• 通过允许复制而不会丢失编码序列来保持染色体的完整性

II.2 计算细胞分裂的数目

• 判断已经发生的细胞分裂次数
• 确定细胞寿命以及何时发生复制性衰老

II.3 提供复制线性DNA末端的机制

• 在滞后链上的不连续复制涉及冈崎片段和必须复制的模板
• 端粒酶（见下文）在3'末端添加六聚体重复序列，从而使DNA聚合酶能够完成相反链的合成

III.端粒维护

III.1 端粒酶

III.1.1 RNA成分：hTERC（人类端粒酶编码的RNA）

• RNA：AAUCCC，由hTERC编码
• 用作TTAGGG合成的模板
• 组成型表达

III.1.2 催化成分：hTERT（人类端粒逆转录酶）

• 从RNA模板合成DNA
• 在大多数体细胞中不表达
• 端粒酶相关蛋白包括hEST2，hTEP1，SSB，DKC1（dyskerin）

III.1.3 机制

• hTERT逆转录合成在常规DNA复制过程中丢失的端粒序列
• hTERT活性是通过添加TTAGGG重复序列来稳定端粒的关键因素

III.1.4 表达

• 超过90％的肿瘤形成可重新激活hTERT表达
• hTERT在大多数体细胞组织中不表达
• hTERT在生殖细胞，永生细胞中表达
• hTERT的失活导致端粒缩短

III.2 端粒独立/端粒延伸替代机制（ALT）

III.2.1 通过ALT合成的端粒长度具有异质性

III.2.2 端粒长度是动态的，有规律地变化

III.2.3 在端粒酶阴性肿瘤中活跃（占所有肿瘤的10-15％）

III.2.4 与上皮来源的细胞相比，在间质来源的细胞中优先活跃

III.2.5 在正常细胞和某些端粒酶阴性细胞中表达的ALT抑制因子（即ALT活性和端粒酶活性可以在同一细胞中共存）

III.2.6 ALT（+）细胞的比例与PML体（早幼粒细胞白血病核体或PML NB）相关

• PML NB由端粒DNA、TRF1、TRF2和PML蛋白组成
• 端粒DNA、TRF1、TRF2和PML蛋白都共定位于ALT（+）细胞中
• 在端粒酶（+）细胞中未观察到共定位
• PML NB在细胞分化、细胞生长、凋亡中的潜在作用，以及维持端粒完整性方面的潜在作用

III.2.7 ALT的机制可能涉及端粒之间的同源重组。通过互补退火从一个端粒复制到另一个端粒的序列，从而引发新的端粒DNA

III.2.8 G环与t环，D环（有关说明，请参见上文）

III.2.9 在酵母中进行的实验：

• 证明DNA修复基因如RAD50、RAD51、RecQ解旋酶的必要性，以使同源重组能够正常发生
• 错配修复通路的抑制已被证明可以增强ALT通路，可能是因为同源重组需要错配修复通路蛋白

IV.衰老和永生

IV.1 Hayflick极限（1961）

• 证明在体外可能会发生有限数量的细胞加倍（在30至50之间）
• 计算并记录细胞加倍数
• 超过加倍的极限会导致细胞衰老或复制

IV.2 端粒和端粒酶

IV.2.1 端粒在细胞衰老中起关键作用

IV.2.2 端粒计数细胞分裂的数目

IV.2.3 端粒酶可以重置细胞分裂计数器：

• 通过修复缩短或受损的端粒
• 抑制端粒酶导致端粒序列丢失，最终导致细胞衰老

IV.2.4 延长人类细胞寿命的两个生物学障碍：

a: M1：复制性衰老或死亡1期（功能是抑制细胞永生化）

b: M2：危机（处于危机中的细胞通常会进入凋亡途径，可以躲避危机阶段的细胞则成活）。这些细胞：

1.表达端粒酶

2.显示相对恒定的端粒长度

3.显示非整倍性

4.显示非互易位

5.总之，这些数据表明，在危机阶段，端粒失去保护能力

IV.2.5 端粒酶在原代（人类）细胞中的表达

• 导致永生
• 提示端粒在M1和M2阶段均活跃，是决定细胞寿命的关键

IV.2.6 端粒造成的足够的损害

• 被认为是DNA损伤
• 启动p53依赖的细胞周期停滞
• 可以诱导细胞衰老

IV.2.7 能够启动衰老的端粒长度阈值

• 可以通过过度表达TRF2进行更改
• 细胞可以检测到端粒结合蛋白浓度降低的染色体，这表明
• 衰老由端粒长度和端粒结合蛋白的作用共同决定

IV.3 永生

• 永生化可以通过激活端粒酶来实现，从而使细胞不再受到生长负控制的限制
• 端粒酶酶亚基在二倍体细胞中的体外表达导致永生化
• 端粒酶的延长或组成型表达也可以诱导永生化
• M1，M2衰老期都有限制寿命的作用

V.老化

V.1 端粒长度的作用

• 端粒酶缺失小鼠的过早衰老可以通过端粒酶表达的激活而得到挽救
• 端粒酶的重新表达可治疗端粒缩短到临界长度阈值以下
• 染色体稳定性恢复

V.2 ATM的作用

• 共济失调-毛细血管扩张症突变基因产物（ATM）
• 识别双链DNA损伤的途径中的整体成分
• 通过与TRF1直接结合参与端粒长度的维持；参与保护端粒免受NHEJ感染
• ATM的丢失会导致DNA修复缺陷（特别是涉及同源重组的途径），细胞周期控制和癌症发病率增加
• ATM-/Terc双敲除小鼠端粒缩短，基因组不稳定性增加，表现出染色体融合、增殖缺陷和早期死亡等特征

V.3 人类疾病早衰

      增加端粒侵蚀率和抑制正常DNA修复的遗传异常在端粒协同作用下发生，从而导致早衰，这种现象出现在以肿瘤为特征的几种疾病中。

• 先天性角化病：端粒酶缺陷，端粒很短；DKC1（dyskerin）蛋白稳定hTERC
• Werner综合征：端粒加速侵蚀
• AT（共济失调-毛细血管扩张）：端粒加速丢失（见上文）
• Bloom综合征（BLM）：BLM DNA解旋酶抑制异常不当重组;与ALT(+)细胞中的TRF2结合;允许重组介导的端粒扩增

V.4 人类端粒位置效应（TPE）

• 定位在端粒附近的基因表达随端粒长度而变化
• 基因表达的可逆抑制
• 受高阶染色质组织的影响
• 调节年龄相关基因表达的机制

VI.基因组不稳定性和肿瘤

VI.1 端粒长度的作用

• 染色体端粒的缩短促进了基因组的不稳定性
• 充足的证据表明肿瘤形成和发展的关键步骤包括端粒酶和端粒的失调
• 达到临界端粒长度时，染色体开始端对端融合，使细胞陷入危机

VI.2 端粒酶的表达

VI.2.1 端粒酶表达的激活与肿瘤直接相关，支持以下观念：端粒和端粒维持是癌症形成的关键

VI.2.2 仅hTERT的表达会导致永生。细胞转化需要永生化，伴随着抑癌基因的失活和细胞癌基因的活化

VI.2.3 端粒缩短可以抑制肿瘤的早期生长；但是，端粒缩短，特别是在细胞周期失调的情况下，可以通过以下方式促进瘤形成：

• 施加有利于永生克隆的选择性压力
• 促进后续遗传变化的积累

VI.2.4 最新数据表明，端粒酶再激活可以不依赖端粒维持途径促进瘤形成

• 稳定染色体变化
• 有利于永生化克隆的生长
• 赋予对细胞凋亡的抗性（一些数据表明，hTERT的表达赋予了该属性）

VI.3 染色体和基因组不稳定性

VI.3.1分子和细胞遗传学研究表明，在端粒完整性恢复之前，即使只有一条未保护的染色体末端，其染色体在遗传学上也是不稳定的。在这段遗传不稳定时期，发生了断裂-融合-断裂（BFB）循环，通常在染色体非整倍体中出现最多。

VI.3.2 BFB循环和染色体不稳定性也会通过非同源末端连接（NHEJ）促进姐妹染色单体融合

VI.3.3 在有丝分裂过程中，双着丝粒中的着丝粒分离到相反的两极会形成后期桥梁，随后染色体断裂，受损末端融合，并促进其他BFB循环

VI.3.4 通过重排染色体获取新的端粒过程中可能会出现基因扩增的循环周期，这表明双链DNA断裂对于促进最接近染色体断裂点的基因扩增非常重要

VI.3.5 为了生存，遗传不稳定的细胞也必须逃避细胞周期调节因子（例如p53）的检测，而p53可以响应受损的DNA诱导生长停滞或凋亡

• 通过p53可以检测到严重缩短的端粒
• p53与富含G的单链突出端粒DNA结合，并且还与t环相互作用
• p53功能的丧失和端粒缩短共同促进肿瘤发生