Ultrastructure du chromosome

 

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Anglais

Introduction

Malgré les progrès réalisés par les techniques d’imagerie et d’analyse biochimique, la structure du chromosome métaphasique reste dans une large mesure inconnue. Une partie de la difficulté qu’il y a à comprendre son architecture est liée au fait qu’il s’agit d’une structure dynamique, transitoire, qui nécessite donc d’être bloquée à un moment précis pour être analysée. Mais dans le même temps où l’on fige un chromosome par une technique d’analyse, on prend le risque d’en modifier la structure.

Malgré tout, la combinaison de différentes approches permettent aujourd’hui d’avoir une vue d’ensemble assez précise de l’architecture du chromosome, bien que de nombreuses pièces manquent encore au puzzle.

En terme fonctionnel, le chromosome représente la forme la plus condensée que prend la molécule d’ADN au cours du cycle cellulaire. Cette condensation maximale est atteinte au moment de la division cellulaire ou mitose, et permet une séparation aisée des molécules d’ADN répliquée dans les deux cellules filles. En effet, la taille d’une molécule d’ADN décondensée est bien supérieure au diamètre de la cellule (environ 14 mm pour le chromosome 21), ce qui impose cette compaction sous la forme de chromosomes au moment de la division. Par ailleurs, au moment de leur assemblage, les chromosomes intègrent les structures indispensables à une séparation équilibrée du matériel génétique entre les deux cellules filles à l’anaphase.

On peut donc envisager deux états fonctionnels du génome pendant le cycle cellulaire :

• Un état décondensé pendant l’interphase, où l’ADN est visible en microscopie optique sous la forme de chromatine dans le noyau et permettant l’expression des gènes.

• Un état condensé au moment de la division, où chaque molécule d’ADN est compactée sous la forme d’un chromosome avec perte provisoire de la fonction transcriptionnelle. De ce point de vue, le chromosome au sens microscopique n’est donc pas un élément stable de la cellule mais une structure dynamique et transitoire.


Morphologie des chromosomes en microscopie optique

Les premières observations des chromosomes remontent à la fin du XIXe siècle, mais il a fallu attendre les années 60 pour que les techniques de préparation permettent de les analyser en détail individuellement.

Le chromosome métaphasique est constitué de deux chromatides, chaque chromatide représentant une des deux molécules d’ADN identiques issues de la réplication en phase S. Ces deux chromatides sont étroitement associées au niveau du centromère, qui constitue la constriction primaire du chromosome et correspond à la zone de fixation sur les fibres du fuseau de division.

Figure 1

La constriction centromérique est un repère qui permet de séparer le chromosome en deux régions principales : un bras court (par convention situé au-dessus du centromère) et un bras long (en-dessous du centromère). Les extrémités des bras chromosomiques sont des régions possédant une architecture particulière sur le plan moléculaire et sont appelées télomère. Il y a un télomère pour le bras court et un télomère pour le bras long.

En fonction de la taille respective des bras courts et longs, on reconnaît trois groupes morphologiques de chromosomes :
● Les chromosomes métacentriques, dont les bras courts et longs sont de taille semblable. L’index centromérique (rapport de la taille du bras court sur la taille du bras court + la taille du bras long) est autour de 0,5. Exemples : chromosomes 1, 2, 3, 16, 19, 20, X.




Figure 2

● Les chromosomes submétacentriques, dont les bras courts sont franchement plus courts que les bras long. L’index centromérique est très inférieur à 0,5. Exemples : chromosomes 4, 5, 6 à 12, 17, 18, Y.




Figure 3
● Les chromosomes acrocentriques, dont le bras court est peu ou pas visible. L’index centromérique est proche de 0. La particularité essentielle de ce groupe de chromosomes est qu’ils hébergent les mêmes gènes sur leur bras courts, qui ont tous une structure identique. Il s’agit des gènes responsables de la synthèse des ARN ribosomiques, présents à plusieurs centaines d’exemplaires dans la cellule. Exemple : chromosomes 13, 14, 15, 21, 22.




Figure 4

Le nombre et l’aspect général des chromosomes sont caractéristiques de chaque espèce, et sont donc identiques chez tous les individus d’une espèce donnée. Il existe cependant certaines régions dont la morphologie peut présenter des variations de taille non pathologiques, appelés polymorphismes. Ces variations sont liées à la présence de séquences répétées en nombre variable, non codantes, ce qui explique l’absence de retentissement clinique. En dehors de ces zones polymorphes, les régions d’ADN répété non codant qui forment l’hétérochromatine constitutive se retrouvent également au niveau des centromères de tous les chromosomes.




Figure 5

La reproductibilité de la forme des chromosomes est un argument en faveur d’une organisation sous-jacente du génome qui, associée aux caractéristiques biochimiques de l’ADN et des protéines associées au sein de la chromatine vont aboutir à cet état hautement hiérarchisé. En même temps, ce processus dynamique de compaction n’est pas spontané, c’est un phénomène actif et à ce titre consommateur d’énergie pour la cellule, et donc étroitement contrôlé.

Structure du chromosome métaphasique

Composition

Les chromosomes sont constitués en proportions à peu près équivalentes d’ADN, de protéines histones et de protéines non histones. In vivo, l’ADN n’est en effet pas libre dans le noyau mais associé à diverses protéines pour former la chromatine. Celle-ci va s’organiser en structures secondaires et tertiaires pour aboutir à une compaction variable au cours du cycle cellulaire, moins importante pendant l’interphase pour permettre la transcription des gènes et maximale pendant la mitose pour faciliter la séparation des deux lots chromosomiques.

La structure de base de la chromatine est le nucléosome, constitué d'un octamère d'histones (2xH2A, 2xH2B, 2xH3 et 2xH4) autour duquel s’enroule la molécule d’ADN (2 tours 1/4 autour de chaque nucléosome, soit 146 paires de bases). Entre deux nucléosomes successifs, on trouve une portion d’ADN « linker » de 200 pb environ chez les organismes supérieurs. La molécule d'ADN est liée aux histones par ses groupements Phosphate (environ une liaison tous les deux tours et demi d'hélice). Une cinquième histone, l'Histone H1, stabilise l'enroulement de l'ADN autour du nucléosome et entraîne une compaction d'un facteur 30.

Figure 6

Cette structure de base qui peut être observée en microscopie électronique sous la forme du « collier de perles » (une molécule d’ADN avec des nucléosomes régulièrement espacés ) a un diamètre de 11 nm mais n’existe pas telle quelle in vivo. Les interactions physico-chimiques entre les nucléosomes (renforcées par les contacts avec des protéines non histone) entraîne la formation d’une structure secondaire de 30 nm de diamètre correspondant à un premier niveau de compaction. Deux modèles existent pour décrire cette fibre de 30 nm :

● soit un modèle de solénoïde dans lequel les nucléosomes successifs s’enroulent autour d’un axe virtuel ;

Figure 7

● soit un modèle en zigzag dans lequel l’ADN linker traverse l’axe d’enroulement entre chaque nucléosome successif.




Figure 8

Cette fibre de 30 nm s'organise en domaines d'environ 1 Mb, eux-mêmes constitués de sous-domaines (ou « rosettes ») de 100 Kb, maintenues par des liaisons entre la base des boucles (SAR = Scaffold Attachment Region) et des protéines de structure.




Figure 9

Les niveaux d'organisation et de compaction supérieurs pour obtenir une chromatide métaphasique sont encore mal identifiés. Plusieurs modèles envisagent divers modes de surenroulements successifs pour aboutir à des fibres de 150 puis finalement 700 nm de diamètre, mais aucune confirmation expérimentale n'est pour le moment venue les valider. Le taux final de compaction du génome dans le chromosome métaphasique est d'environ 10.000 x par rapport à une molécule d'ADN linéaire (Belmont, 2002).
Malgré l'incertitude sur les mécanismes de la compaction, la structure finale du chromosome métaphasique a pu être étudiée grâce à l'utilisation de différentes approches expérimentales.

Architecture en microscopie électronique et de force atomique

La microscopie de force atomique est basée sur la détection des variations de force atomique entre une sonde et l'échantillon (Forces de Vander Waals). La sonde remplace l'objectif traditionnel des microscopes et se déplace au-dessus de l'échantillon pour enregistrer ces variations, à partir desquelles une image est reconstituée. Cette technique permet d'obtenir une résolution de l'ordre du nanomètre et de visualiser en détail la surface des chromosomes (Ushiki et al., 2002). Cette surface est irrégulière, alternant reliefs et sillons correspondant grossièrement aux bandes G et R. Les chromatides sont constituées par «l'enroulement» d'une fibre de 200 nm de diamètre, elle-même constituée par une fibre de 50 nm de diamètre repliée sur elle-même. L'arrangement de la fibre de 50 nm est plus dense au niveau des bandes G que des bandes R. La microscopie de force atomique ne permet malheureusement que de visualiser la surface du chromosome et ne donne aucune information sur l'arrangement interne de la fibre de chromatine.

L'utilisation de la microscopie électronique à permis d'obtenir les premières informations sur l'architecture interne du chromosome métaphasique Après extraction des histones par une solution de forte force ionique ou riche en polyanions, on observe un halo de boucles d'ADN en périphérie d'un squelette protéique central ayant grossièrement la forme du chromosome métaphasique (Paulson and Laemmli, 1977). Ces boucles représentent environ 100 Kb d'ADN et correspondent aux rosettes de la fibre de 30 nm, insérées par leur base dans la structure protéique centrale au niveau des SAR. En faisant varier les conditions ioniques du milieu, on observe des variations morphologiques du squelette protéique, qui s'étire ou se contracte de façon réversible (Earnshaw and Laemmli, 1983).

Composition de l’axe protéique

Deux principales protéines sont constitutives de ce “squelette” interne du chromosome : la Topoisomérase II et les Condensines I et II.
La Topoisomérase est une protéine dont la fonction est de supprimer les super tours au niveau de la molécule d’ADN et de supprimer les nœuds créés par l’activité des différentes enzymes actives au niveau de l’ADN. La Topoisomérase II a la capacité de couper la molécule d’ADN, de faire passer le brin coupé en dehors de la boucle et de ressouder les deux extrémités. Cette fonctionnalité est essentielle pour permettre une séparation correcte des deux chromatides soeurs pendant l’étape de condensation des chromatides en prophase. Un déficit en Topoisomérase II se traduit alors par un défaut de condensation des chromosomes, avec pour conséquence une séparation incomplète des deux lots chromosomiques en anaphase et la persistance de masse de chromatine au niveau du plan de division cellulaire (Chang et al., 2003). Cette protéine n’est cependant pas un composant fixe de l’axe protéique, elle en constitue au contraire un élément dynamique en renouvellement permanent (Christensen et al., 2002).

Le deuxième constituant essentiel de l’axe chromosomique est la Condensine, dont il existe deux sous types, Condensine I et II. Ces protéines sont en fait des complexes multiprotéiques associant 2 sous unités SMC (SMC2 et SMC 4 pour Structural Maintenance of Chromosome) et 3 sous unités non SMC (CAP H/H2, CAP D2/D3, CAP G/G2). Les deux sous unités SMC s’associent pour former un V porteur d’un site de fixation pour l’ATP à l’extrémité de chacune des deux branches.

Figure 10

Les sous-unités non SMC permettent de contrôler l’ouverture de la pince constituée par les deux protéines SMC. Grâce à l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP, les Condensines ont la capacité de se lier à l’ADN et de générer des supertours et des boucles, ce qui entraîne une condensation de la chromatine. Le rôle exact des deux sous-types Condensine I et II n’est pas clairement identifié, mais il semble que la Condensine II intervienne en premier dans les étapes précoces de la condensation, alors que la Condensine I interviendrait plus tard pour stabiliser la chromatine dans cet état compacté (Ono et al., 2003). De manière surprenante au regard du rôle présumé des Condensines, leur inactivation n’entraîne pas une abolition de la compaction, qui survient malgré tout mais de façon retardée et incomplète. Cette compaction imparfaite entraîne cependant une morphologie anomale des chromosomes en raison d’une désorganisation de l’axe protéique des chromatides, ainsi qu’une ségrégation anormale en raison de masses chromatiniennes persistantes au niveau de la plaque équatoriale en fin d’anaphase (Hudson et al., 2003).

Un dernier type de protéine ne faisant pas partie du squelette protéique stricto sensu, joue néanmoins un rôle fondamental dans la structure et la physiologie du chromosome métaphasique : il s’agit des Cohésines.




Figure 11

Ces protéines appartiennent à la même famille que les Condensines et ont une structure semblable, constituées de 4 sous-unités spécifiques (2 sous unités SMC 1 et 3, et deux sous unités non SMC), RAD21 (REC8 pour les Cohésines méiotiques) et SA1. Les Cohésines sont associées à la chromatine pendant la phase S, au moment de la réplication de l’ADN et servent à maintenir ensemble les deux chromatides sœurs jusqu’à leur séparation lors de la division cellulaire. Cette séparation des Cohésines se fait en deux étapes, une première phase contrôlée par les kinases Aurora B et Polo pendant la prophase aboutissant à une séparation des chromatides au niveau des bras chromosomiques. Ne persistent alors que les Cohésines centromériques pour assurer la cohésion des chromatides pendant l’alignement des chromosomes sur la plaque équatoriale au moment de la métaphase. La deuxième phase de séparation des Cohésines survient alors, par dégradation de RAD21 par la séparase activée par APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) lors du déclenchement de l’anaphase (Losada, 2007).

Assemblage du chromosome métaphasique

Topoisomérase II et Condensine II sont présentes pendant l’interphase dans le noyau. En revanche, la Condensine I a une localisation cytoplasmique et ne peut s’associer aux chromosomes qu’après la disparition de l’enveloppe nucléaire (Ono et al., 2004). En début de prophase, on observe une phosphorylation de la Topoisomérase II et de la Condensine II entraînant leur association avec la périphérie de la chromatine en cours de compaction (Swedlow and Hirano, 2003). Cette association permet un premier niveau de compaction de la fibre de 30 n pour aboutir à une fibre de 200 - 250 nm de diamètre via la formation de multiples connexions interchromatiniennes. Puis, un deuxième niveau de compaction apparaît en fin de prophase suite à la réorganisation des protéines de structures qui deviennent axiales et assurent la stabilisation de l’enroulement de la fibre de 250 nm en une fibre de 700 nm de diamètre (Kireeva et al., 2004). La condensine I semble jouer un rôle prépondérant dans la stabilisation finale de la structure du chromosome. Un point essentiel de cette architecture chromosomique est son caractère dynamique, caractérisée par un flux permanent de protéines qui s’associent et se dissocient en permanence de l’axe protéique qui n’est pas une structure fixe (Christensen et al., 2002).

La compaction de la chromatine en un chromosome métaphasique est régulièrement présentée comme une étape indipensable à la ségrégation des chromosomes de par le raccourcissement qu’elle induit. En fait, les observations effecuées ces dernières années tendent à prouver qu’il n’en n’est rien et que la longueur du chromosome varie peu de l’interphase à la métaphase. Ceci a été démontré par mesure en fluorescence de la longueur du chromosome interphasique (Lemke et al., 2002) et par le suivi des foci de réplication au cours de la compaction dans des cellules vivantes (Manders et al., 1999). La compaction permettrait essentiellement à une séparation des chromatides sœurs, alors que l’étape finale de raccourcissement de la longueur des chromatides ne surviendrait pour l’essentiel qu’en anaphase (Mora-Bermudez et al., 2007).

Conclusion

Le chromosome métaphasique, en tant que structure biologique, n’a pas encore révélé tous ses secrets. Les progrès réalisés ces dernières années ont permis de montrer qu’il s’agit d’une construction dynamique résultant de la stabilisation par des protéines spécifiques d’un réseau de connexions intrachromatiniennes aboutissant à une compaction très importante du matériel génétique. La formation de ces connexions entre les boucles de chromatine est un phénomène encore mal compris mais très régulé comme en atteste la reproductibilité des bandes chromosomiques obtenues après divers traitements, soit par la chaleur (Bandes R) soit par digestion enzymatique par la Trypsine (Bandes G) et coloration par le Giemsa.

En outre, ces bandes traduisent probablement l’existence d’une architecture différente de ces boucles dans différentes régions du génome, aboutissant à une sensibilité variable aux techniques de banding et donc à une colorabilité différente par le Giemsa. Les expériences réalisées dans les années 1990 par l’équipe de Saitoh (Saitoh and Laemmli, 1994) suggèrent que le squelette protéique aurait une organisation hélicoïdale au niveau des bandes G, avec des boucles d’ADN en moyenne de plus petite taille, et une organisation plus linéaire et centrale au niveau des bandes R avec des boucles d’ADN de plus grande taille.

Figure 12

Adapté d’après Cell, 76, Y Saitoh and UK Laemmli, Metaphase chromosome structure: Bands arise from a differential folding path of the highly Atrich scaffold , 609-622, 1994, avec la permission d’Elsevier.

Ces différences créeraient une sensibilité variable aux traitements de banding et une colorabilité différente par les colorants primaires constitutifs du Giemsa (Eosine, Bleu de Méthylène, Azure A et Azure B) des différentes régions en fonction de la concentration locale en protéines et ADN. La question de savoir pourquoi y a-t-il une architecture différente au niveau des bandes G et des bandes R n’est pas tranchée aujourd’hui, la responsabilité évoquée d’une différence du rapport AT/GC entre les bandes G et les bandes R ne semblant pas en mesure d’expliquer ce phénomène.

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Contributor(s)

Written	2008-06	Jean-Michel Dupont
		Histologie Embryologie Cytogénétique, HÈpital Cochin, 123 Bd Port Royal, 75014 Paris, France