CRISPR/Cas9: sistema inmune bacteriano
CRISPR significa 'Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats' (que en español quiere decir Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas). Las bacterias tienen estos fragmentos de ADN repetitivos entre los que se intercalan pequeños fragmentos de ADN exógeno de virus que le servirán para defenderse de una infección viral (Figura 1). Cuando un virus infecta a una bacteria por primera vez, si la bacteria sobrevive será capaz de guardar en su propio genoma fragmentos del genoma del virus. Si un mismo virus vuelve a aparecer, la bacteria será capaz de defenderse. Para ello utilizará una proteína nucleasa, Cas9 (CRISPR asociated protein 9), que será dirigida a cortar y destruir el ADN exógeno del virus invasor. Por eso, se dice que el sistema CRISPR/Cas9 es un tipo de sistema inmunitario bacteriano. 1,2
Figura 1: CRISPR significa “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” (que en español quiere decir Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas). Los distintos círculos representan secuencias provenientes de las diferentes infecciones virales sufridas por la bacteria y los rectángulos negros representan las secuencias repetidas.
El primer científico en descubrir las secuencias CRISPR fue Francis Mojica que estaba trabajando con una arquea de las salinas de Santa Pola. Sus resultados fueron publicados en 1993. 3 Además, fue el primero en proponer una posible función de esta agrupación de secuencias repetitivas. En los siguientes años, varios grupos de investigación estuvieron trabajando en identificar la función de CRISPR. 4 En 2012 Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna propusieron que este sistema de las bacterias podría ser utilizar como herramienta de edición genómica. 5 Esto ha supuesto una revolución en el área de la genética y biotecnología ya que permite la posibilidad de editar el genoma de cualquier célula. En 2013, Feng Zhang, otro investigador importante en el campo de CRISPR, publicó por primera vez el uso de CRISPR/Cas9 para editar células de humano y ratón. 6
CRISPR/Cas9: herramienta de edición genómica
La tecnología CRISPR/Cas9 es la herramienta de edición genómica más eficiente, específica y rápida hasta la fecha. 7,8 Se basa fundamentalmente en dos componentes: una secuencia corta de ARN (sgRNA) -la secuencia ARN guía que brinda especificidad al sistema-, y unas “tijeras” enzimáticas que cortan el ADN (Cas9 con actividad nucleasa). El sgRNA, compuesto por 20 nucleótidos, sirve de guía a la nucleasa Cas9 para que corte en un sitio específico del genoma, en la diana de interés. Esto provoca la activación de la reparación del ADN que introducirá pequeñas inserciones y deleciones que pueden provocar un codón de parada prematuro en el gen de interés. Es imprescindible que la secuencia ADN complementaria a la sgRNA posea un motivo adyacente protoespaciador, conocido como PAM (protospacer adjacent motif), en su extremo 3’, es decir, los gRNAs pueden transportar Cas9 a cualquier parte del genoma para la edición de genes, pero no se puede editar en cualquier sitio distinto al que Cas9 reconoce como PAM. En el caso de la Cas9, esta secuencia PAM consiste en 5’-NGG-3’ donde N es cualquier nucleótido.
Aplicaciones de CRISPR
El reciente desarrollo de las nuevas técnicas de edición del genoma como el sistema de CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR) ha abierto un amplio abanico de posibilidades (Figura 2, Tabla 1). 9
Figura 2: Aplicaciones de la tecnología de CRISPR/Cas9 en el campo de la biomedicina.
Este sistema es muy efectivo para generar mutaciones de pérdida de función. 10 También es capaz de generar alteraciones citogenéticas 11 como deleciones genómicas grandes o translocaciones cromosómicas mediante el uso de dos sgRNA a la vez, o bien generar mutaciones puntuales en presencia de una secuencia específica que se inserte en el gen que deseemos editar. 12 Así, a través de vectores que contengan Cas9 y sgRNAs se pueden introducir diferentes alteraciones en el ADN que mimeticen las mutaciones somáticas que ocurren en los pacientes.
Además, existen algunas variantes de Cas9 que permiten alcanzar otras aplicaciones. Por ejemplo, la deadCas9 (dCas9), que presenta los dominios catalíticos inactivados, no es capaz de cortar el ADN y sólo actúa como elemento de reconocimiento de una región del genoma de interés determinada. La dCas9 junto con un elemento activador o represor permitiría la sobreexpresión o infraexpresión de un gen, respectivamente. Así, por ejemplo, el sistema CRISPR/SAM (complejo mediador de activación sinérgica) se basa en el uso de dCas 9 fusionado a un dominio de activación de la transcripción (VP64) que es guiado por un sgRNA a una región localizada a - 200 pb del punto de inicio de la Transcripción (TSS) del gen de interés que queramos sobreexpresar. 13 El sistema CRISPRi (CRISPR interference) puede reprimir la expresión de genes al utilizar la dCas9 con un dominio represor. 14 También se puede modificar el ADN a nivel epigenético. 15
La mutagénesis dirigida mediante librerías CRISPR a escala genómica supone un paso más en la tecnología de edición genética y presenta ventajas con respecto a otras aproximaciones ya “clásicas” (librerías de RNAi y librerías de cDNA). Estas librerías CRISPR consisten en un conjunto o pool de sgRNAs, dirigidos contra todos los genes del genoma, que permiten generar, en un solo experimento, una colección en la que cada célula tendrá mutado un gen diferente. Las librerías contienen 3-6 sgRNAs por gen para garantizar que se editen los genes. En los screenings de selección positiva, se introduce una fuerte presión, por ejemplo, con un fármaco, para que identificar los genes que están implicados en la resistencia a un fármaco ya que sólo sobreviven las células que tengan mutaciones en estos genes. En la selección negativa, se pueden identificar los genes que son necesarios o esenciales para la supervivencia de las células. Se basa en el crecimiento continuado durante un periodo prolongado de tiempo y aquellas células que mueran serán las que presentan mutaciones en genes esenciales. Para identificar los genes relevantes en ambos tipos de screenings, hay que realizar la secuenciación masiva NGS. 16
Se han descrito otros sistemas CRISPR que también están siendo bastante utilizados hoy en día y han aumentado las aplicaciones de esta tecnología. Entre ellos, destacan los sistemas CRIPSR-Cas12a (o CRISPR-Cpf1) y CRISPR-Cas13. 17 Mientras que la Cpf1 es capaz de cortar el ADN como la Cas9 con la singularidad de que usa otra secuencia PAM (5’-TTTN-3’), la Cas13 tiene capacidad de cortar ARN (y no ADN). Estos sistemas han permitido el desarrollo recientemente de tests diagnósticos para detectar enfermedades, denominados DETECTR 18 y SHERLOCK. 19 De hecho, en los últimos meses, se han aplicado estas tecnologías para detectar la presencia del genoma de ARN del coronavirus SARS-Cov-2, causante de la COVID-19. 20,21 El principal reto de estas aplicaciones es demostrar la sensibilidad y fiabilidad frente a las pruebas estandarizadas de RT-PCR.
Limitaciones de CRISPR y posibles soluciones
Pese a que la tecnología CRISPR/Cas9 presenta numerosas ventajas comparado con otras herramientas de edición genética, los investigadores deben de ser conscientes de las limitaciones que también pueden presentar. El principal obstáculo de esta tecnología es la generación de posibles modificaciones no deseadas en otras regiones del genoma (off-targets, fuera de la diana). 22 Aunque parece que son difíciles de predecir, existen diversos programas bioinformáticos que permiten identificar in silico los off-targets de cada sgRNA. 23,24 Si estas modificaciones se producen en secuencias codificantes podrían llegar a producir el silenciamiento de un gen pudiendo tener consecuencias relevantes. Por eso, hay diversos métodos que permiten reducir estos off-targets. Por ejemplo, las Cas9 nickasas (nCas9) son una variante de las Cas9 con un dominio inactivo pudiendo sólo cortar una hebra de ADN, en vez de producir una rotura de doble cadena en el ADN. La combinación de dos nickasas genera cortes en cada una de las dos hebras de ADN simulando la actividad de la Cas9. Se ha demostrado que estas nickasas logran reducir la aparición de efectos off-targets en las células dianas. Por el contrario, también se ha demostrado una menor eficiencia on-target en algunos casos.
También se están utilizando algunas variantes de la Cas9, high-fidelity Cas9 (Cas9-HF), que presentan una mayor especificidad con la región de interés que se desea editar con el objetivo de reducir los off-targets. 25 Otra variante más recientemente descrita de los sistemas CRISPR es la aplicación Prime Editing descubierta por el grupo de David Liu. En este caso, en vez de un sgRNA standard, se utiliza una versión extendida (perRNA o guía de edición de calidad) que se podrá aparear a la otra cadena de ADN y dirigir la síntesis de nuevo ADN a partir del ARN gracias a la actividad transcriptasa reversa asociada a la proteína Cas9 nickasa que se encargará de abrir el ADN en una de las cadenas para que se extienda. El ARN utilizado puede incluir pequeñas variaciones que serán posteriormente copiadas en el ADN que se quiere editar 26. Esta tecnología permite también solventar de alguna manera otra de las limitaciones de CRISPR: la baja eficiencia para generar mutaciones puntuales o corregir regiones mutadas mediante reparación dirigida por recombinación homóloga (HDR) cuando se introduce una secuencia molde junto con las Cas9 y el sgRNA.
A parte de los efectos off-targets y de la baja eficiencia de CRISPR cuando se emplea HDR como método de reparación del genoma, también hay que tener en cuenta que se han detectado anticuerpos frente a la nucleasa Cas9 en humanos lo que podría desencadenar una respuesta inmune que provoque la destrucción del material transferido o de las células diana. 27
Aplicaciones de CRISPR en el campo de la hematología
Las aplicaciones de CRISPR/Cas9 en el campo de la hematología son enormes. 28,29 Varios estudios publicados han modelado diversos tipos de neoplasias hematológicas generando modelos in vitro o in vivo reproduciendo las alteraciones genéticas de los pacientes. 30,31,32,33,34 Esto está permitiendo definir mejor los drivers de cada enfermedad con estudios funcionales para conocer su impacto biológico o realizar screenings de nuevos fármacos. Las librerías CRISPR están permitiendo evaluar los mecanismos de resistencia contra fármacos. 35 Además, se están empezando a desarrollar las aplicaciones de CRISPR/Cas9 con usos terapéuticos como la terapia génica contra enfermedades hematológicas hereditarias 36,37 o la producción de linfocitos T editados para que sean más eficientes contra las células tumorales, 38,39 que están consiguiendo grandes avances en el campo de la inmunoterapia.
Financiación: Contrato Postdoctoral Sara Borrell CD19/00222) del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), cofinanciado por el Fondo Social Europeo (FSE) “El Fondo Social Europeo invierte en tu futuro” (MHS).
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María Hernández-Sánchez
Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology 2021-06-01
Online version: http://atlasgeneticsoncology.org/teaching/30158/crispr-cas9-herramienta-de-edici-n-gen-mica