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Telomeri

I. Struttura dei telomeri nei mammiferi I.1. Sequenza di DNA I.2. t-loops, G-loops, D-loops I.3. Componenti Proteici II. Funzione dei telomeri II.1. Stabilità Cromosomica II.2. Contatore di Divisione Cellulare II.3. Meccanismo per la Replicazione del DNA delle porzioni terminali II.4. Integrità Cromosomica III. Mantenimento Telomerico III.1. Telomerasi III.2. Telomere-Independent/Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) IV. Senescenza e Immortalizzazione IV.1. Limite di Hayflick IV.2. Telomeri e Telomerasi IV.3. Immortalizzazione V. Invecchiamento V.1. Ruolo della Lunghezza dei Telomeri V.2. Ruolo di ATM V.3. Disordini umani dell'Invecchiamento Prematuro V.4. Effetto della Posizione Telomerica (TPE) VI. Instabilità genomica e Neoplasie VI.1. Ruolo della Lunghezza dei Telomeri VI.2. Espressione della Telomerasi VI.3. Instabilità cromosomica e genomica

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I. STRUTTURA DEI TELOMERI NEI MAMMIFERI

Tutti i cromosomi degli eucarioti si concludono con i telomeri, strutture costituite da DNA e proteine associate, i quali definiscono le estremità di ogni cromosoma linearizzato.

I.1. Sequenza di DNA

• Le porzioni terminali dei cromosomi lineari sono composte da un repeat (TTAGGG)

• L'esamero è presente in circa 2,000 copie (superiore a 15 kb di DNA)

• 50-150 bp di DNA terminale vengono perse ad ogni transizione attraverso il ciclo cellulare

• "L'erosione" naturale dei telomeri contribuisce ad una miriade di processi fisiologici (vedi pi avanti)

 

I.2. t-loops, G-loops, D-loops

• I telomeri presentano un'estremità 3' ricca in G

• Si forma un t-loop quando l'estremità al 3' a singolo filamento si ripiega ad ansa appaiandosi alle sequenze esameriche a doppio filamento; poichè il filamento ricco in G rimuove un'elica viene a formarsi una D, o loop di sfasamento.

• La conformazione t-loop conferisce protezione dalle esonucleasi.

 

I.3.Componenti Proteiche

Le proteine associate ai telomeri includono:

I.3.1. TRF1 (telomeric repeat binding factor 1)

• Espressa ubiquitariamente durante tutto il ciclo cellulare

• Si lega, con elevata specificità, al TTAGGG repeat come un omodimero (in corrispondenza dei t-loops)

• Funziona in cis per inibire l'allungamento (elongation) dipendente dalla telomerasi

• Partecipa alla regolazione del fuso mitotico

• E' regolata a rotazione dalle proteine: TIN2, TANK1, TANK2 (vedi di seguito)

• Regolatore negativo dell'allungamento telomerico (pathway dipendente dalla telomerasi)

• Alcuni dati suggeriscono un ruolo per TRF1 nella risposta alle rotture del DNA a doppio filamento breaks

I.3.2. TRF2 (telomeric repeat binding factor 2) 2)

• Espressa ubiquitariamente durante tutto il ciclo cellulare

• Si lega, con elevata specificità, al TTAGGG repeat come un omodimero

• Localizzata ai t-loops, è coinvolta nella loro formazione

• Il dominio C-terminale è omologo ai protooncogeni della famiglia MYB

• Potrebbe essere coinvolta nell'inibizione della forca replicativa

• Stabilizza il filamento sporgente ricco in G e inibisce le fusioni telomero-telomero

• I telomeri TRF2-negativi sono riconosciuti come DNA danneggiato

• Regolatore negativo della lunghezza del telomero; l'overespressione di TRF2 nelle cellule somatiche = accorciamento telomerico

• L'inibizione di TRF2 causa l'apoptosi e la ricombinazione di telomeri non-omologhi (non-homologous end joining; NHEJ).

• Promuove il legame di hRAP1, una proteina associata ai telomeri

I.3.3. hRAP1

• Omologo umano della proteina di lievito

• Regolatore negativo, in cis, della lunghezza dei telomeri

• Interazione C-terminale mediata con TRF2

• Funzione nella determinazione della lunghezza telomerica relativa

I.3.4. TIN2 (TRF1-interacting nuclear factor 2)

• Regola la lunghezza telomerica attraverso il legame con TRF1 mediato dall'NH2-terminale

• Il mutante TIN2 mancante della porzione terminale NH2, porta all'estensione dei telomeri

• Promuove l'appaiamento TRF1-dipendente dei repeats telomerici

I.3.5. TANK1/TNKS (tankyrase, TRF1-interacting ankyrin-related polymerase)

• Attività Poly(ADP-ribose) polimerasica (PARP)

• La ADP-ribosilazione di TRF1 mediata dalla Tankyrasi, inibisce il legame ai repeats telomerici

• Promuove l'estensione telomerica

  I.3.6. TANK2/TNKS2 (tankyrase 2) :

• Correlata a TANK1

• L'overespressione induce la morte necrotica delle cellule

  I.3.7. WRN (prodotto genico della sindrome di Werner) :

• Sotto famiglia delle RecQ elicasi

• Richiesta per la replicazione del DNA

• Coinvolta nel controllo della stabilità genomica

N.B. Quindi l'attività telomerica pu essere compromessa mediante l'alterazione della funzione di proteine associate al telomero.

 

 

II. FUNZIONE TELOMERICA

II.1. Conferisce Stabilità e Protegge le Terminazioni Cromosomiche

• Protezione dalle esonucleasi cellulari

• Protezione dalle ricombinazioni non-omologhe

• Permette alle cellule di discriminare tra terminazioni cromosomiche normali e danneggiate

• Preserva l'integrità dei cromosomi permettendo la replicazione senza perdita delle sequenze codificanti

 

II.2. Conteggio delle divisioni cellulari

• Valuta il numero delle divisioni cellulari che sono avvenute

• Determina la vita media cellulare e quando una cellula entra in senescenza replicativa

   

  II.3. Fornisce il meccanismo per la replicazione delle porzioni terminali del DNA

• La replicazione discontinua sul filamento 'lento' (lagging) coinvolge i frammenti di Okazaki e il templato che deve essere replicato

• La telomerasi (vedi oltre) aggiunge le sequenze ripetute esameriche al 3' terminale, permettendo alla DNA polimerasi di completare la sintesi del filamento opposto

 

III. MANTENIMENTO TELOMERICO

III.1. Telomerasi

III.1.1. Componente ad RNA: hTERC (human telomerase encoded RNA)

• RNA: AAUCCC, codificata da hTERC

• Serve da templato per la sintesi di TTAGGG

• Espressa constitutivamente

 

III.1.2. Componente Catalitica: hTERT (human telomere reverse transcriptase)

• Sintetizza il DNA da un templato di RNA

• Non è espressa nella maggioranza delle cellule somatiche

• Le proteine associate alla telomerasi includono hEST2, hTEP1, SSB, DKC1(dyskerin)

 

III.1.3. Meccanismo

• La trascrizione inversa mediante hTERT sintetizza le sequenze telomeriche perse durante la replicazione del DNA

• L'attività di hTERT è un fattore critico nella stabilizzazione dei telomeri attraverso l'aggiunta di TTAGGG repeats

 

III.1.4. Espressione

• Più del 90% delle neoplasie riattivano l'espressione di hTERT

• hTERT non è espresso nella maggior parte dei tessuti somatici

• hTERT è espresso nelle cellule germinali, e nelle cellule immortalizzate

• L'inattivazione di hTERT determina un accorciamento dei telomeri

 

III.2. Allungamento dei telomeri alternativo (alternative lengthening of telomeres; ALT) indipendente dalla telomerasi

III.2.1. La lunghezza dei telomeri sintetizzati mediante ALT è di norma eterogenea

III.2.2. La lunghezza dei telomeri è dinamica, varia regolarmente

III.2.3. Attivo nelle neoplasie indipendenti dalla telomerasi (~10-15% di tutte le neoplasie)

III.2.4. Preferenzialmente attiva nelle cellule di derivazione mesenchimale, confrontate con quelle di origine epiteliale

III.2.5. Repressori di ALT espressi nelle cellule normali e in certe cellule telomerasi-negative (i.e., l'attività di ALT e l'attività telomerasica pu co-esistere nelle stesse cellule)

III.2.6. Le proporzioni di cellule ALT(+) sono associate con i corpi di PML (promyelocytic leukemia nuclear body, or PML NB)

• PML NB comprendono DNA telomerico, proteine TRF1, TRF2, e PML

• Il DNA telomerico, le proteine TRF1, TRF2 e PML co-localizzano tutte nelle cellule ALT(+)

• La co-localizzazione non è osservata nelle cellule telomerasi-positive (+)

• Ruolo potenziale per PML NB nel differenziamento cellulare, nella crescita cellulare, nell'apoptosi, e un indefinito ruolo nel mantenimento dell'integrità telomerica

III.2.7. Meccanismo di ALT probabilmente coinvolto nella ricombinazione omologa tra telomeri; sequenze copiate da un singolo telomero a un altro attraverso l'appaiamento complementare che funge da innesco per la sintesi del nuovo DNA telomerico.

III.2.8. G-loop vs. t-loop, D-loop (vedi sopra per la descrizione dei ruoli)

III.2.9. Esperimenti ottenuti in lievito :

• Hanno dimostrato la necessità di proteine per la riparazione del DNA quali RAD50, RAD51, RecQ elicasi per far si che la ricombinazione omologa avvenga in modo corretto

• L'inibizione dei pathways per la riparazione dei mismatch hanno mostrato un incremento nell'attività dei pathway di ALT, presumibilmente perchè la ricombinazione omologa richiede proteine del pathway per la riparazione dei mismatch

 

 

IV. SENESCENZA E IMMORTALIZZAZIONE

IV.1. Limite di Hayflick (1961)

• Dimostrazione che in vitro è possibile un numero limitato di duplicazioni cellulari (tra 30-50)

• Il numero di duplicazioni cellulari è contato e registrato dalla cellula

• Il superamento del limite di duplicazioni induce l'invecchiamento cellulare, o replicativo

 

IV.2. Telomeri and Telomerasi

IV.2.1. I telomeri hanno una funzione critica nell'invecchiamento cellulare

IV.2.2. I telomeri rilevano il numero di divisioni cellulari

IV.2.3. La telomerasi pu azzerare l'effetto delle divisioni cellulari:

• Attraverso la riparazione dei telomeri accorciati o danneggiati

• L'inibizione delle telomerasi causa la perdita delle sequenze telomeriche e eventualmente l'invecchiamento cellulare

IV.2.4. Sussistono due impedimenti biologici nel prolungare la vita media delle cellule umane:

a. M1:senescenza replicativa, o mortalità nelle fase 1 (Ha la funzione di inibire l'immortalizzazione cellulare)

b. M2: crisi (le cellule in crisi di solito entrano nel pathway apoptotico, quelle che possono eludere la fase di crisi immortalizzano). Queste cellule:

1. Esprimono la telomerase
2. Mostrano una lunghezza telomerica relativamente costante
3. Mostrano aneuploidia
4. Mostrano traslocazioni non-reciproche
5. Insieme, questi dati suggeriscono che nella fase di crisi, i telomeri perdono la capacità protettiva

IV.2.5. Espressione della telomerasi nelle cellule primarie (umane)

• Causa immortalizzazione

• Suggerisce che i telomeri sono attivi in fase M1 e M2 e sono fondamentali per la determinazione della vita media cellulare

IV.2.6. L'entità del danno sostenuto dai telomeri

• E' riconosciuto come danno del DNA

• Dà inizio all'arresto del ciclo cellulare p53- dipendente

• Può indurre invecchiamento cellulare

IV.2.7. La soglia della lunghezza telomerica in grado di indurre senescenza

• Pu essere cambiata dall'overespressione di TRF2

• Le cellule possono rilevare cromosomi con una ridotta concentrazione di proteine associate al telomero (ipotesi suggerita)

• L' invecchiamento è determinato dalla lunghezza del telomero e causato delle proteine legate al telomero

IV.3. Immortalizzazione

• L'immortalizzazione può essere realizzata attraverso l'attivazione della telomerasi, così che quelle cellule non sono pi limitate dal controllo negativo della crescita

• L'espressione in vitro delle subunità enzimatiche della telomerasi nelle cellule diploidi causa immortalizzazione

• La prolungata o costitutiva espressione della telomerasi pu indurre immortalizzazione

• Le fasi M1, M2 dell'invecchiamento funzionano entrambe per imporre un limite alla vita media della cellula

 

 

V. INVECCHIAMENTO

V.1. Ruolo della lunghezza dei telomeri

• L'invecchiamento prematuro visto nei topi mancanti della telomerasi pu essere inibito dalla riattivazione dell'espressione della telomerasi

• La re-espressione della telomersi riporta i telomeri accorciati ad una soglia di lunghezza critica

• La stabilità cromosomica è ristabilita

 

V.2. Ruolo di ATM

• Nell'ataxia-telangectasia è mutato il prodotto genico (ATM)

• Componente integrale nel pathway che riconosce il danno al doppio filamento di DNA

• Coinvolto nella mantenere la lunghezza del telomero attraverso il legame con TRF1; partecipa alla protezione dei telomeri dal NHEJ

• La perdita di ATM risulta in difetti di riparazione del DNA (in modo particolare quei pathways coinvolti nella ricombinazione omologa),nel controllo del ciclo cellulare e nell'aumento dell'incidenza di cancro

• I topi knockout per ATM-/Terc mostrano telomeri accorciati, aumento dell'instabilità genomica che si riflette in fusioni cromosomiche, difetti nella proliferazione e morte precoce

 

V.3. Disordini Umani di Invecchiamento Prematuro

Aberrazioni genetiche che aumentano il tasso di erosione del telomeri e inibiscono la normale riparazione del DNA a livello del telomero, sinergizza nel causare invecchiamento precoce, un fenomeno visto in molti disordini che mostrano la predisposizione alle neoplasie.

• Discheratosi congenita: telomerasi difettosa con molti telomeri corti; DKC1 (dyskerin) proteina che stabilizza hTERC

• Sindrome di Werner: accelerata erosione telomerica

• A-T (ataxia-telangiectasia): accelerata perdita telomerica (vedi sopra)

• Sindrome di Bloom (BLM): la DNA elicasi BLM sopprime ricombinazioni anormali; lega TRF2 nelle cellule ALT(+); permette l'amplificazione telomerica mediata dalla ricombinazione

   

  V.4. Telomere Position Effect (TPE) nell'Uomo

• L'espressione di geni mappati vicino al telomeo varia in accordo alla lunghezza del telomero

• Soppressione reversibile dell'espressione genica

• Influenzato da un pi alto livello di organizzazione della cromatina

• Meccanismo mediante il quale pu essere regolata l'espressione genica correlata all'età cellulare

 

 

VI. INSTABILITA' GENOMICA E NEOPLASIE

VI.1. Ruolo della lunghezza dei telomeri

• L'instabilità genomica è facilitata in presenza di telomeri accorciati

• I dati suggeriscono fortemente che gli step cruciali nello sviluppo e progressione della neoplasia includono la disregolazione dei telomeri e della telomerasi

• Quando una lunghezza critica del telomero è stata raggiunta, i cromosomi iniziano a fondere le loro estremità, portando le cellule in crisi.

 

VI.2. Espressione della Telomerasi

VI.1.1. La riattivazione dell'espressione della telomerasi correla direttamente con le neoplasie, supportando la teoria che il mantenimento della telomerasi e dei telomeri porta alla formazione dei tumori.

VI.1.2. L'espressione di hTERT da sola causa l'immortalizzazione; la trasformazione cellulare richiede l'immortalizzazione accompagnata dall'inattivazione di geni soppressori tumorali e l'attivazione di oncogeni cellulari.

VI.1.3. L'accorciamento del telomero pu servire per inibire molti stadi della crescita tumorale; comunque, l'accorciamento telomerico, particolarmente nel contesto di una disregolazione del ciclo cellulare, pu facilitare la neoplasia mediante:

• Esercitando una pressione selettiva che favorisce i cloni immortalizzati

• Promuovendo l'accumulo di cambiamenti genetici

VI.1.4. Recenti dati suggeriscono che la riattivazione della telomerasi contribuisce allo sviluppo della neoplasia attraverso pathways indipendenti del mantenimento telomerico

• Stabilizzando cambiamenti cromosomici

• Favorendo la crescita di cloni immortalizzati

• Conferendo resistenza all'apoptosi (alcuni dati suggeriscono che l'espressione di hTERT conferisce questo attributo)

VI.3. Instabilità Cromosomica e Genomica

VI.3.1. Studi molecolari e citogenetici hanno identificato che i cromosomi con anche una sola estremità non protetta sono geneticamente instabili fino a che l'integrità telomerica non viene ristabilita. Durante questo periodo di instabilità genomica, avvengono delle fusioni tra due estremità cromosomiche (breakage-fusion-bridge BFB), culminanti spesso in aneuploidie cromosomiche.

VI.3.2. BFB cycles e l'instabilità cromosomica promuovono anche le fusioni tra cromatidi fratelli mediante il non-homologous end joining (NHEJ).

VI.3.3. Durante la mitosi, la separazione dei centromeri nei cromosomi dicentrici ai poli opposti produce un ponte anafasico, seguito dalla rottura del cromosoma, la conseguente fusione delle parti terminali danneggiate e la promozione di BFB cycles.

VI.3.4. Ricorrenti cicli di amplificazione genica possono originarsi durante l'acquisizione di nuovi telomeri attraverso i riarrangiamenti dei cromosomi, suggerendo che le rotture del DNA a doppio strand sono importanti nella promozione dell'amplificazione di geni prossimali al punto di rottura cromosomica.

VI.3.5. Al fine di sopravvivere, le cellule geneticamente instabili devono anche evadere la rilevazione da parte dei regolatori del ciclo cellulare, come p53, che pu indurre l'arresto del ciclo cellulare o apoptosis in risposta al DNA danneggiato

• I telomeri pi corti possono essere identificati da p53

• P53 si lega al G-rich, DNA telomerico a singolo filamento e interagisce anche con il t-loop

• La perdita della funzione di p53 e l'accorciamento del telomero lavorano insieme per promuovere la tumorigenesi

 

Collaboratore : Azra H. Ligon

Traduzione : Matteo Brioschi and Alessandro Beghini

Matteo Brioschi, Alessandro Beghini