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I. Concetto di eterocromatina
II. Due tipi di eterocromatina

    II.1. Eterocromatina costitutiva
    II.2. Eterocromatina facoltativa

III. Proprietà dell'eterocromatina

    III.1. L'eterocromatina è condensata
    III.2. Il DNA eterocromatinico è replicato tardivamente
    III.3. Il DNA eterocromatinico è metilato
    III.4. Nell'eterocromatina, gli istoni sono ipo-acetilati
    III.5. Gli istoni dell'eterocromatina sono metilati alla lisina 9
    III.6. L'eterocromatina è trascrizionalmente inattiva
    III.7. L'eterocromatina non partecipa nella ricombinazione genica
    III.8. L'eterocromatina ha un istinto di aggregazione

IV. Fattori coinvolti nell'eterocromatinizzazione

    IV.1. Vasta gamma di sequenze ripetute in tandem
    IV.2. Metilazione del DNA
    IV.3. Ipo-acetilazione degli istoni
    IV.4. Metilazione di H3-K9
    IV.5. Proteine HP1
    IV.6. RNA nucleari

V. Funzioni dell'eterocromatina

    V.1. Ruolo dell'eterocromatina nell'organizzazione dei domini nucleari
    V.2. Ruolo dell'eterocromatina nella funzione centromerica
    V.3. Ruolo dell'eterocromatina nella repressione (regolazione epigenetica)

VI. Malattie eterocromatiniche

    VI.1. Disordini dell'eterocromatina costitutiva
    VI.2. Disordini dell'eterocromatina facoltativa

VII. Conclusione

I. Concetto di eterocromatina

Definizione di cromatina

Negli eucarioti, al contrario dei procarioti, il DNA è impacchettato sotto forma di complesso nucleoproteico chiamato "cromatina", che porta il messaggio dell'ereditarietà. Essa è localizzata nel nucleo ed è organizzata in molte entità separate, i cromosomi.

Concetto di eterocromatina

Nel 1928, basandosi su osservazioni istologiche, Emil HEITZ definì l'eterocromatina (HC) come segmenti cromosomali che appaiono estremamente condensati e di colore scuro nel nucleo interfasico. Infatti, la cromatina consiste di un groviglio di fibre, il cui diametro non solo varia durante il ciclo cellulare, ma dipende anche dalle regione del cromosoma osservato. L'eucromatina attiva consiste di una fibra con un diametro corrispondente a quello di un nucleosoma, un segmento di DNA a doppio filamento, avvolto attorno a un omodimero di istoni H2A, H2B, H3, e H4. Nell'eucromatina inattiva, questa fibra può avvolgersi su se stessa in una solenoide grazie agli istoni H1. Inoltre è organizzata mediante l'interazioni con le proteine non istoniche (topoisomerasi II, proteina scaffold 2, laminine...). Quanto all'eterocromatina, come definito sopra, la sua fibra costitutiva è molto condensata e spesso appare composta di aggregati. Coinvolge numerose proteine aggiuntive, includendo le proteine HP1 (Heterochromatin Protein 1).

II. Due tipi di eterocromatina

Ci sono due tipi di eterocromatina, l'eterocromatina costitutiva e quella facoltativa, che differiscono di poco, in base al DNA che esse contengono. La ricchezza in DNA satellite determina la permanente o reversibile natura dell'eterocromatina, i suoi polimorfismi e le sue proprietà di colorazione.

•  L'eterocromatina costitutiva contiene un particolare tipo di DNA chiamato DNA satellite, che presenta numerose piccole sequenze ripetute in tandem: DNA Alpha-satellite, DNA satellite I, II e III. Queste sequenze di DNA satellite sono in grado di ripiegarsi su loro stesse e potrebbero avere un importante ruolo nella formazione di strutture altamente compatte dell'eterocromatina costitutiva.
  
• L'eterocromatina costitutiva è stabile e conserva le sue proprietà eterocromatiniche durante tutte le fasi dello sviluppo e in tutti i tessuti.
  
• L'eterocromatina costitutiva è altamente polimorfica, ciò è dovuto probabilmente all'instabilità del DNA satellite. Questo polimorfismo può intaccare non solo la dimensione ma anche la localizzazione dell'eterocromatina, e apparentemente non ha effetti fenotipici. 
• L'eterocromatina costitutiva è colorata in maniera più intensa mediante il bandeggio C, che è il risultato della rapida rinaturazione del DNA satellite in seguito alla denaturazione.

II.2. Eterocromatina facoltativa

• L'eterocromatina facoltativa è caratterizzata dalla presenza di sequenze ripetute LINE-type. Queste sequenze, disperse nel genoma, potrebbero promuovere la propagazione di una struttura cromatinica condensata.
  
• L'eterocromatina costitutiva è reversibile, il suo stato eterocromatinico dipende dalla fase dello sviluppo o dal tipo cellulare esaminato. La X inattiva (corpo di Barr) nelle cellule somatiche femminili e la vescicola sessuale inattiva alla fase del pachitene della meiosi maschile mostra due esempi di eterocromatina facoltativa.
  
• L'eterocromatina costitutiva non è particolarmente ricca in DNA satellite, e quindi non è polimorfica.
  
• L'eterocromatina costitutiva non è colorata mediante in bandeggio C.

III. Proprietà dell'eterocromatina

A dispetto delle differenze sopra descritte, l'eterocromatina costitutiva e quella facoltativa hanno molte proprietà simili.

     III.1. L'eterocromatina è condensata

La condensazione è l'aspetto che definisce l' eterocromatina, ed è applicabile sia all'eterocromatina costitutiva sia a quella facoltativa. Questa alta condensazione la rende fortemente cromofilica e inaccessibile alla DNAse 1 e in generale ad altri enzimi di restrizione.

III.2. Il DNA eterocromatinico è replicato tardivamente

L'incorporazione di vari nucleotidi analoghi mostra che il DNA sia dell'eterocromatina costitutiva sia di quella facoltativa, e replicato tardivamente. La replicazione tardiva dell'eterocromatina risulta, da un lato, dal suo alto grado di condensazione, che previene che il macchinario replicativo abbia un facile accesso al DNA, e dall'altro, dalla sua localizzazione nel dominio periferico del nucleo che è povero di elementi attivi.

III.3. Il DNA eterocromatinico è metilato

• Il DNA dell'eterocromatina costitutiva è altamente metilato alla citosina. Un anticorpo anti-5-methyl-cytosine infatti marca fortemente tutte le regioni dell'eterocromatina costitutiva.
  
• Per quanto riguarda l'eterocromatina facoltativa, la metilazione del DNA è più discreta, ma gli enzimi di restrizione sensibili alla metilazione rivelano una forte metilazione delle CpG islands, che sono localizzate in modo specifico nelle regioni di controllo dei geni.

III.4. Nell'eterocromatina, gli istoni sono ipo-acetilati

Gli istoni potrebbero andare incontro a modificazioni post traduzionali delle loro code N-terminali che potrebbero influire sull'attività genetica della cromatina.

• L'ipo-acetilazione delle code N-terminali istoniche, principalmente a carico delle lisine, è associata alla cromatina inattiva. Al contrario, l'iper-acetilazione degli istoni caratterizza la cromatina attiva.
  
• L'acetilazione e la de-acetilazione degli istoni sono meccanismi assolutamente essenziali per il controllo dell'espressione genica. Numerosi fattori trascrizionali sono stati visti avere un'attività acetil transferasica dell'istone o una'attività de-acetylasica dell'istone.

III.5. Gli istoni dell'eterocromatina sono metilati alla lisina 9

Recentemente la metilazione dell'istone H3 alla lisina 9 (H3-K9) è risultata coinvolta nel processo di eterocromatinizzazione del genoma, sia nell'eterocromatina costitutiva sia nella facoltativa.

III.6. L'eterocromatina è trascrizionalmente inattiva

• A differenza della Drosophila, l'eterocromatina costitutiva umana non contiene alcun gene e incorporando l'uridina triziata nella coltura cellulare non risulta alcuna marcatura a nessun livello.
  
• L'eterocromatina facoltativa è relativamente povera di geni, e normalmente i suoi geni non vengono trascritti in un contesto eterocromatinico.

III.7. L'eterocromatina non partecipa nella ricombinazione genetica

• E' generalmente accettato che l'eterocromatina costitutiva non partecipa nella ricombinazione genetica. Non ci sono appaiamenti di regioni eterocromatiniche omologhe probabilmente perché il polimorfismo che caratterizza le regioni eterocromatiniche lo rende difficile se non impossibile. L'eterocromatina costitutiva agisce anche nel reprimere la ricombinazione nelle adiacenti regioni eucromatiniche.
  
• Per quanto riguarda l'eterocromatina facoltativa, essa non partecipa nella ricombinazione meiotica quando è nella sua forma inattiva.

III.8. L'eterocromatina tende all'aggregazione

Lo studio di vari organismi ha mostrato che l'eterocromatina costitutiva ha una naturale tendenza all'aggregazione durante l'interfase.

• Nelle larve di Drosophila, i centromeri dei cromosomi politenici, che sono ricchi in eterocromatina, durante l'interfase possono aggregarsi a formare i cromocentri.
  
• Nel topo, il numero di blocchi eterocromatici che possono essere osservati nei nuclei interfasici è sempre più basso del numero delle regioni eterocromatiche visualizzate sui cromosomi metafisici.
  
• Negli umani, i bracci corti dei cromosomi acrocentrici, principalmente formati da eterocromatina, nel nucleo interfasico sono frequentemente associati con altri cromosomi aventi un grande blocco eterocromatinico (1, 9 e 16).

Questa tendenza ad aggregare della cromatina sembra essere fortemente legata alla presenza di sequenze di DNA satellite, ma potrebbero essere coinvolte anche altre sequenze aggiuntive.

IV. Fattori coinvolti nell'eterocromatinizzazione

Certe osservazioni hanno portato all'identificazione di vari elementi che hanno un ruolo importante nella formazione dell'eterocromatina, sia essa costitutiva o facoltativa.

      IV.1. Vasta gamma di sequenze ripetute in tandem

• Il DNA satellite visualizzato mediante FISH colocalizza esattamente con l'eterocromatina costitutiva. Inoltre, il DNA satellite ha la distintiva caratteristica di ripiegarsi e avvolgersi su se stesso, e questo potrebbe essere un importante fattore nella determinazione della struttura estremamente compatta dell'eterocromatina costitutiva.
  
• Comunque, questo non riguarda solo il DNA satellite. Nelle piante, nella Drosophila, e anche nel topo, certi transgeni multicopie sono a malapena espressi, o non sono espressi del tutto, persino quando non sono soggetti a repressione centromerica.

Queste differenti osservazioni suggeriscono che la ripetizione in tandem di una sequenza di DNA in un gran numero di copie è sufficiente di per se stessa per dirigere la formazione dell'eterocromatina. Simili sequenze ripetute potrebbero seguire la cromatina per essere compattate a una più grande estensione, con la formazione di strutture caratteristiche. Queste strutture potrebbero essere riconosciute da proteine specifiche, come le proteine HP1, che dirigono la formazione di un più alto ordine di cromatina.

IV.2. Metilazione del DNA

Le grandi ripetizioni di transgeni non portano tutte a un' inattivazione trascrizionale del transgene. Il silenziamento indotto dalle ripetizioni in tandem sembra essere legato alla presenza di sequenze di DNA procariotico, ricche in CpG, prone a essere metilate. Poi la composizione in basi delle ripetizioni in tandem potrebbe quindi giocare un importante ruolo nella formazione dell'eterocromatina.

• E'interessante, l'osservazione recente che ha dimostrat come la methyl binding protein MeCP2, che normalmente si lega alle citosine del DNA metilato, sia anche in grado di reclutare la de-acetilasi istonica (Figura 1). La metilazione del DNA potrebbe poi indurre una de-acetilazione degli istoni e quindi promuovere l'eterocromatinizzazione.
  
• Comunque, la metilazione del DNA non è indispensabile per la formazione dell'eterocromatina. Potrebbe essere un elemento coinvolto nella stabilizzazione. Infatti nei marsupiali, l'X inattiva non è metilata ed è molto meno stabile che nei mammiferi uterini.

• Infatti, l'acetilazione delle lisine rimuove la carica positiva degli istoni, quindi riduce la forza di attrazione con la carica negativa del fosfato del DNA e porta ad una più ampia apertura della cromatina.
  
• In contrasto, la de-acetilazione della lisina ristabilisce la loro carica positiva e quindi promuove una forte attrazione con il DNA, portando ad una cromatina condensata.

IV.4. Metilazione di H3-K9

La metilazione dell'istone H3 alla lisina 9 è una modificazione epigenetica che è stata recentemente vista essere coinvolta nel processo di eterocromatinizzazione, non solo nell'eterocromatina costitutiva ma anche sull'X inattiva. L'enzima responsabile per questa metilazione è l'histone methyltransferase SUV30H1.

• Su H3-K9, l'acetilazione e la metilazione sembrano essere mutuamente esclusive. Nella Drosophila, inoltre, la methyltransferase Suv39h è associata con una de-acetylase istonica, suggerendo un singolo meccanismo molecolare che segue la diretta conversione di una lisina 9 acetilata in una lisina 9 metilata.
• In aggiunta, la metilazione di H3-K9 crea un sito di legame ad alta affinità per la proteina eterocromatica HP1. La co-immunoprecipitazione di Suvar39h con HP1 suggerisce un meccanismo di eterocromatinizzazione basato sull'interazione di queste due proteine e la lisina 9.
• Infine, nella Neurospora crassa, recentemente è stato visto che la metilazione di H3-K9 può causare la metilazione del DNA (Figura 2).

• Nella Drosophila, la proteina HP1 è codificata dal gene Su(var)205, che è un soppressore di variegazione che possono modificare l'effetto PEV. possono essere descritte come segue: i geni che normalmente sono localizzati nell'eucromatina attiva, in seguito a riarrangiamenti cromosomici, sono posizionati nella regione centromerica che è eterocromatina. Poi, la cromatina appena traslocata diventa molto compatta, e si associa con le proteine HP1 che sono normalmente confinate nei centromeri. Infine, i geni contenuti nella cromatina traslocata vengono repressi.
  
• Nel topo, l'inserzione di un transgene all'interno del centromero potrebbe avere simili conseguenze.

è interessante notare allo stesso tempo che dove un transgene è represso, non come risultato di un effetto centromerico ma come risultato della sua presenza in molteplice copie, anche le proteine HP1 sono state trovate essere associate con la repressione della cromatina.

Le proteine HP1 sembrano essere un link essenziale nella formazione dell'eterocromatina, e potrebbero avere il ruolo di organizzatrici del dominio cromatinico. Queste proteine sembrano essere in grado di riconoscere particolari strutture che si creano dall'appaiarsi e/o associarsi di sequenze di DNA ripetute. In aggiunta, grazie al chromodomain (CD) e al chromoshadow domain (CSD), esse sono in grado di stabilire le interazioni secondarie con un gran numero di altre proteine.

IV.6. RNAs nucleari

• E' già chiaramente ben stabilito che certi RNA nucleari sono in grado di contribuire alla formazione di eterocromatina facoltativa. I trascritti del gene XIST hanno un ruolo essenziale nell'iniziazione dell'inattivazione facoltativa di un cromosoma X, nelle cellule somatiche nei mammiferi femmine.
  
• Alcuni recenti studi nel topo hanno suggerito che i trascritti nucleari potrebbero anche essere coinvolti nella formazione delleterocromatina costitutiva. Nelle cellule di topo, l'eterocromatina centromerica è caratterizzata da un'alta concentrazione di istone H3-K9 metilato e proteine eterocromatiche HP1, che sono rapidamente de-localizzate dopo un'incubazione con RNAse A. Questo suggerisce che l'RNA nucleare potrebbe essere un essenziale componente strutturale delle'eterocromatina costitutiva.

V. Funzioni dell'eterocromatina

Il ruolo preciso dell'eterocromatina nel genoma umano rimane un mistero, così come i suoi frequenti polimorfismi non appaiono avere alcun effetto funzionale e fenotipico.

      V.1. Ruolo di HC nell'organizzazione dei domini nucleari

• L'eterocromatina e l'eucromatica occupano differenti domini nucleari. L'eterocromatina è generalmente localizzata alla periferia del nucleo ed è attaccata alla membrana nucleare. In contrasto, la cromatina attiva occupa una porzione più centrale.
  
• La localizzazione preferenziale dell'eterocromatina contro la membrana nucleare potrebbe essere dovuta all'interazione della proteina HP1 con il recettore lamin B, che è un componente integrale della membrana interna del nucleo.
  
• La localizzazione periferica dell'eterocromatina concentra gli elementi attivi verso il centro del nucleo, in seguito l'eucromatina attiva replica ed è trascritta con la massima efficienza.

V.2. Ruolo dell'eterocromatina nella funzione centromerica

In molti eucarioti, i centromeri sono caratterizzati dalla presenza di eterocromatina. E' stato suggerito che l'eterocromatina centromerica sia necessaria per la coesione di cromatidi fratelli e che segue la normale disgiunzione di cromosomi mitotici.

• Nel lievito Schizosaccharomyces pombe, l'omologo della proteina HP1 Swi6 è assolutamente essenziale per una efficiente coesione di cromatidi fratelli durante la divisione cellulare.
  
• Infine, esperimenti che coinvolgono la delezione di DNA satellite mostrano che una grande regione di ripetizioni di DNA satellite è indispensabile per il corretto funzionamento del centromero.

E' ipotizzabile che l'eterocromatina centromerica sia in grado di creare un compartimento con l'aumento della concentrazione locale della variante istonica centromerica, CENP-A, e promuovere l'incorporazione di CENP-A piuttosto che dell'istone H3 durante la replicazione.

V.3. Ruolo dell'HC nella repressione genica (regolazione epigenetica)

L'espressione genica potrebbe essere controllata a due livelli:

• In primo luogo, a livello locale c'è il controllo trascrizionale, grazie alla formazione di complessi trascrizionali locali. Questo livello coinvolge relativamente piccole sequenze di DNA legate a geni individuali.
  
• Ad un livello più generale,viene controllato il potenziale trascrzionale, che coinvolge molte sequenze che rappresentano un grande dominio cromatinico, presente sia in uno stato attivo sia in uno stato inattivo. L'eterocromatina sembra essere coinvolta nel controllo trascrizionale del genoma. I geni che sono normalmente localizzati nell'eucromatina possono, quindi, essere silenziati quando sono posizionati all'interno del dominio eterocromatinico.

Meccanismi di inattivazione in cis:

In seguito a riarrangiamenti cromosomali, una regione eucromatinica potrebbe essere scambiata con una con una regione eterocromatinica. Nelle regioni in cui il riarrangiamento rimuove normali barriere che proteggono l'eucromatina, la struttura eterocromatinica è in grado di propagarsi in cis all'adiacente eucromatina, quindi inattivare i geni in essa contenuti. Questo meccanismo è stato osservato in position effect variegation (PEV) nella Drosophila e anche nell'inattivazione di certi transgeni nel topo.

Meccanismi di inattivazione in trans:

Durante il differenziamento cellulare, alcuni geni attivi sono adatti per essere trasportati in un dominio nucleare eteocromatico, quindi causando la loro inattivazione. Come è stato proposto un meccanismo così c'è una spiegazione per la co-localizzazione nei nuclei dei linfociti della proteina IKAROS e dei geni dei quali essa controlla l'espressione, con l'eterocromatina centromerica.

VI. Disordini eterocromatinici

    VI.1. Disordini dell'eterocromatina costitutiva

    Generalmente questi difetti sono il risultato di un'alterazione nel processo di differenziazione cellulare.

• Essi potrebbero essere costituzionali, come nel caso delle sindromi ICF o di Roberts. La sindrome ICF associa Immunodeficienza, instabilità Centromerica e anomalie Facciali. Essa è una patologia rara recessiva che è legata a mutazioni del gene DNMT3B, una DNA metil transferasi. I satelliti G-C rich, DNAsi I e III sono particolarmente demetilati, e possono causare anormale segregazione dei cromatidi fratelli, formazione di figure multiradiali, delezioni, micronuclei, ecc.
  
• Essi potrebbero acquistare: le anomalie dell'eterocromatina costituzionale, coinvolgenti sia il DNA sia le proteine eterocromatiniche, che sono state trovate in molti tipi di cancro.
  
  • in particolare, il linfoma non-Hodgkin e i mielomi multipli sono stati visti essere associati con anomalie della costrizione secondaria del cromosoma 1, simili a quelle osservate nella sindrome ICF. Infatti, è stato visto che c'è una globale ipometilazione del genoma, associata, in particolare, con una ipometilazione del DNA satellite II.
    
  • nel cancro al cervello metastatico, è stato visto che c'è una diminuzione nell'alfa proteina HP1, che è una proteina localizzata nelle regioni eterocromatiniche dei cromosomi.

VI.2. Disordini dell'eterocromatina facoltativa

• essi possono risultare da un difetto nell'inattivazione di un cromosoma X nelle cellule somatiche femminile (mutazione nel gene XIST) e potrebbe portare all'espressione di un una patologia X-linked nelle femmine.
  
• Essi possono risultare da un difetto nella condensazione nelle vescicole sessuali nelle cellule germinali maschili, portando alla sterilità dovuta a arresto nella fase di pachitene della meiosi.

VII. Conclusione

In conclusione, sebbene l'eterocromatina sia apparentemente amorfa e isolata alla periferia del nucleo, essa sembra avere un ruolo assolutamente essenziale nell'organizzazione e funzione del genoma. Mediante questa review noi abbiamo presentato principalmente le caratteristiche legate all'eterocromatina, sia essa costitutiva o facoltativa. Abbiamo visto che le proprietà dell'eterocromatina costitutiva non sono fondamentalmente differenti da quelle della facoltativa. Sembra chiaro che i meccanismi coinvolti nell'eterocromatinizzazione facoltativa, che sono meccanismi epigenetici, sono gli stessi meccanismi che intervengono nella repressione dell'eucromatina in generale.

Patrizia Colapietro, Alessandro Beghini